TH-NTN基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療帕金森病模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、帕金森病(PD)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其基本的臨床癥狀包括靜止性震顫、僵硬、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)異常等。由于PD是一種逐漸進(jìn)展的變性疾病，常導(dǎo)致多種運(yùn)動(dòng)障礙，且患病人數(shù)逐年增加，因此對(duì)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)影響已經(jīng)越來越大。其主要病理變化是黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元的變性，結(jié)果導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)含量明顯減少。目前治療PD的主要方法有藥物治療、手術(shù)治療、細(xì)胞移植和基因治療。藥物和手術(shù)治療對(duì)PD起到緩解癥狀的

2、作用，不能延緩或阻止疾病進(jìn)程。細(xì)胞移植治療通過移植細(xì)胞替代損失的DA能神經(jīng)元以恢復(fù)黑質(zhì)多巴胺的神經(jīng)傳遞，雖有效果但不持久。目前認(rèn)為：理想的PD治療方法應(yīng)該不僅能糾正腦內(nèi)DA含量的不足，而且能保護(hù)殘留的DA能神經(jīng)元，基因治療是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的最佳途徑之一，已成為PD治療的研究熱點(diǎn)。
　　 基因治療通過把目的基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)再進(jìn)行腦內(nèi)移植或者通過質(zhì)?；虿《据d體直接把目的基因轉(zhuǎn)染到腦內(nèi)病變部位。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)因來源豐富，

3、取材簡(jiǎn)便，在體外易于培養(yǎng)和擴(kuò)增，且自體移植克服了免疫排斥和倫理道德等特點(diǎn)，而成為理想的載體細(xì)胞。常用的外源基因主要包括促進(jìn)DA合成的酶類如酪氨酸羥化酶(TH)、各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因及抗凋亡基因等。其中TH是DA合成過程中的限速酶，是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)DA能神經(jīng)元的蛋白標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)把外源性的TH基因?qū)隤D模型大鼠紋狀體內(nèi)，可增加腦內(nèi)DA的水平，改善阿撲嗎啡(APO)誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)癥狀，對(duì)PD有治療作用。
　　 Neurturin(NTN)

4、在結(jié)構(gòu)和功能上與膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)有關(guān)，二者同屬于GDNF亞家族，對(duì)DA能神經(jīng)元具有特異性的營(yíng)養(yǎng)、支持、保護(hù)和損傷修復(fù)作用。研究證實(shí)NTN在體內(nèi)外都能促進(jìn)胚胎中腦神經(jīng)元的存活，阻止神經(jīng)退行性病變的發(fā)生，是治療PD的一種有效的神經(jīng)保護(hù)因子。
　　 研究發(fā)現(xiàn)將TH或NTN基因修飾的細(xì)胞分別移植到PD大鼠腦內(nèi)，均能明顯改善PD大鼠的行為、提高紋狀體內(nèi)DA含量。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)單基因不足以維持DA水平及癥狀的持續(xù)改善，

5、目前研究趨向于多基因共轉(zhuǎn)染的治療方法；研究發(fā)現(xiàn)與單轉(zhuǎn)染TH組相比，將TH與AADC(芳香族氨基酸脫羧酶，DA合成過程中一種重要的酶)共轉(zhuǎn)染PD大鼠紋狀體后行為學(xué)改變較明顯，且不依賴外源性四氫喋呤(BH4)，而單轉(zhuǎn)染TH組只有在外源性四氫喋呤(BH4)存在時(shí)才可檢測(cè)到DA。本研究將TH和NTN結(jié)合起來進(jìn)行基因治療，設(shè)想此方法既可增加腦內(nèi)DA的合成，同時(shí)又能保護(hù)DA能神經(jīng)元，二者協(xié)同作用以達(dá)到雙重治療效果。而目前將TH和NTN雙基因共轉(zhuǎn)染B

6、MSCs腦內(nèi)移植治療PD的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 本研究首先利用密度梯度離心法對(duì)BMSCs進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增，研究其生物學(xué)特性、增殖情況以及相關(guān)特異性抗原的表達(dá)，以證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs：隨后利用含有兩個(gè)多克隆位點(diǎn)pIRES質(zhì)粒，將TH和NTN基因串聯(lián)起來的，構(gòu)建TH和NTN雙基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染到BMSCs中，獲得穩(wěn)定攜帶pIRES-TH-NTN的BMSCs，并測(cè)定TH-NTN-BMSCs中TH和NTN mRN

7、A和蛋白的表達(dá)；最后將TH-NTN-BMSCs移植到PD大鼠紋狀體區(qū)，觀察對(duì)PD模型大鼠的治療作用，并通過多種手段對(duì)移植前后PD大鼠行為學(xué)、特異性神經(jīng)遞質(zhì)、組織學(xué)以及相關(guān)基因與蛋白進(jìn)行比較分析，為PD的基因治療探索一種新的有效的方法。本研究分為以下三個(gè)部分：
　　 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定
　　 方法：
　　 1.無菌條件下獲取大鼠骨髓，密度梯度離心法分離BMSCs，進(jìn)行原代培養(yǎng)。

8、>　　 2.BMSCs傳代培養(yǎng)，采用MTT法測(cè)定其生長(zhǎng)活性。
　　 3.利用流式細(xì)胞技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定CD34和CD29分子的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.接種后24h內(nèi)，體積較大的圓型細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)：2～3d后細(xì)胞大部分貼壁，開始大量伸展：數(shù)天后，細(xì)胞增殖旺盛，從形態(tài)學(xué)上判斷為BMSCs。
　　 2.傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，生長(zhǎng)活性測(cè)定結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，吸光度值逐漸增加，在培養(yǎng)第6～

9、11d時(shí)，細(xì)胞增殖最為迅速。
　　 3.流式檢測(cè)CD34陽性率僅為2.40％，而CD29陽性率高達(dá)93.93％，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CD29呈陽性，CD34呈陰性表達(dá)，利用排除法確定培養(yǎng)細(xì)胞為BMSCs。
　　 第二部分 TH-NTN雙基因表達(dá)載體的構(gòu)建及體外表達(dá)
　　 方法：
　　 1.利用pMD18T-TH和pcDNA-NTN質(zhì)粒獲取TH和NTN基因，構(gòu)建pIRES-TH-NTN載體，并進(jìn)行酶切及基因測(cè)序

10、鑒定。
　　 2.利用脂質(zhì)體2000將pIRES-TH-NTN載體轉(zhuǎn)染到BMSCs中，并利用G418進(jìn)行篩選。
　　 3.利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TH-NTN-BMSCs中TH和NTN mRNA的表達(dá)。
　　 4.利用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定轉(zhuǎn)染24h、36h、48h及72h后，TH-NTN-BMSCs中TH和NTN蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.酶切及基因測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建pIRES-TH-N

11、TN載體。
　　 2.轉(zhuǎn)染及G418篩選后，獲得穩(wěn)定攜帶pIREs-TH-NTN的BMSCs。
　　 3.TH和NTN mRNA在TH-NTN-BMSCs中的表達(dá)高于BMSCs。
　　 4.TH-NTN-BMSCs中TH和NTN蛋白表達(dá)高于BMSCs；
　　 第三部分 TH-NTN基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)帕金森病模型大鼠的治療作用
　　 方法：
　　 1.采用兩點(diǎn)注射法，大鼠右側(cè)黑質(zhì)注

12、射6-羥基多巴胺(6-OHDA)致單側(cè)損毀，制備PD動(dòng)物模型，大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。
　　 2.術(shù)后2、4、6、8w大鼠腹腔注射APO0.5mg/kg，對(duì)模型大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。
　　 3.成功模型大鼠分為PD組(未移植組)、BMSCs組(移植BMSCs)和TH-NTN組(移植TH-NTN-BMSCs)，利用微量進(jìn)樣器將BMSCs和TH-NTN-BMSCs移植到PD模型大鼠右側(cè)紋狀體，移植前對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行5-溴脫氧

13、尿嘧啶(BrdU)標(biāo)記。
　　 4.移植2、4、6、8w后對(duì)各組大鼠注射APO，并記錄30min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。
　　 5.采用高效液相-電化學(xué)法(HPLC-EC)檢測(cè)PD組大鼠左右側(cè)及移植后各組大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)組織勻漿液DA及DOPAC含量。
　　 6.采用免疫組化法測(cè)定PD組大鼠左右側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH及移植后各組大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)TH和NTN表達(dá)。
　　 7.采用RT-PCR和Western blotting測(cè)定

14、移植后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)TH和NTN mRNA和蛋白含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠右側(cè)黑質(zhì)注射6-OHDA2w后，開始出現(xiàn)少動(dòng)、豎毛、行動(dòng)遲緩，躬身等異常表現(xiàn)，注射APO后，對(duì)照組始終無恒定旋轉(zhuǎn)行為，模型組大鼠出現(xiàn)健側(cè)單向旋轉(zhuǎn)行為，連續(xù)記錄30min的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)作為PD動(dòng)物行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)。旋轉(zhuǎn)圈數(shù)超過7r/min視為成功模型，成功模型大鼠達(dá)到84只(占73.68％)。
　　 2.移植后各組大鼠行為

15、學(xué)觀察可見，BMSCs組及TH-NTN組大鼠較PD組自主活動(dòng)增加，TH-NTN組大鼠表現(xiàn)更為明顯。APO誘發(fā)下2w、4w、6w及8wTH-NTN組較PD組和4w、6w及8w時(shí)較BMSCs組30min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.PD組大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)DA及DOPAC含量較對(duì)側(cè)顯著降低，其中，8w時(shí)DA含量較對(duì)側(cè)降低約76.30％，DOPAC含量較對(duì)側(cè)降低82.79％。
　　 4.2w、4w、6w及8w T

16、H-NTN組較PD組和4w、6w及8w時(shí)較BMSCs組大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)DA和DOPAC含量均顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.免疫組化結(jié)果顯示PD組大鼠損毀側(cè)(右側(cè))黑質(zhì)缺乏TH陽性細(xì)胞，而對(duì)側(cè)存在明顯的TH陽性細(xì)胞。
　　 6.免疫組化結(jié)果顯示移植后細(xì)胞在腦內(nèi)存活，與BMSCs組相比，TH-NTN組細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)。與PD組及BMSCs組相比，TH-NTN組大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)TH和NTN蛋白表達(dá)顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

17、br>　　 7.RT-PCR和western blotting結(jié)果提示與PD組及BMSCs組相比，TH-NTN組大鼠紋狀體區(qū)TH和NTN mRNA和蛋白含量顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，2～3d后細(xì)胞大部分貼壁且開始伸展，繼續(xù)培養(yǎng)后增殖旺盛，其中6～11d增殖趨勢(shì)明顯，流式細(xì)胞技術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)顯示CD29為陽性，CD34為陰性，鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為BMSCs。

18、
　　 2.成功構(gòu)建pIRES-TH-NTN質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至BMSCs中，獲得穩(wěn)定攜帶pIRES-TH-NTN的TH-NTN-BMSCs，TH-NTN-BMSCs中TH和NTN基因大量轉(zhuǎn)錄并穩(wěn)定表達(dá)TH和NTN蛋白。
　　 3.單側(cè)雙點(diǎn)法成功制備大鼠PD模型，將TH-NTN基因修飾后的BMCSs移植到PD大鼠腦內(nèi)，與BMSCs組相比，細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)，大鼠行為功能明顯改善，紋狀體區(qū)TH和NTN的mRNA和蛋白含量顯著增加，且D