tMfn2基因?qū)Υ笫笱芷交〖毎鲋车淖饔门c機制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：tMfn2基因重組腺病毒的包裝及其在VSMCs中的表達
　　 1. 目的：
　　 采用脂質(zhì)體（LipofectamineTM 2000）轉(zhuǎn)染方法將攜帶tMfn2基因的腺病毒骨架質(zhì)粒包裝成重組腺病毒（Adv-tMfn2），并在體外培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）中表達，觀察基因轉(zhuǎn)染情況。
　　 2.方法：
　　 利用LipofectamineTM 2000法將經(jīng)

2、PacI 線性化的pAd-tMfn2轉(zhuǎn)染HEK 293A細胞進行包裝，待大部分細胞變圓、漂浮后收集細胞。PCR方法證實為復制缺陷型tMfn2基因重組腺病毒，之后進行大量擴增。采用氯化銫梯度離心法純化病毒，將病毒液進行分裝，-80℃保存。利用分光光度計測定重組腺病毒滴度。采用Western blot方法檢測tMfn2目的基因在VSMCs中的表達。
　　 3.結(jié)果：
　　 融合基因序列正確，PCR可檢測到1.3kb的特異性條

3、帶并排除野生病毒株。腺病毒Adv-tMfn2 滴度為66.424×109 pfu/ml。Western blot結(jié)果表明Adv-tMfn2感染VSMCs后能有效表達出相應的蛋白。
　　 4.結(jié)論：
　　 利用脂質(zhì)體和293A細胞可在體外方便、快捷地構(gòu)建攜帶tMfn2基因的復制缺陷型腺病毒，易進行擴增純化，從而獲得大量高滴度病毒液。tMfn2基因可在VSMCs中高水平表達出目的蛋白，為進一步研究其對VSMCs增殖和凋亡的影

4、響奠定了基礎。
　　 第二部分：tMfn2基因?qū)Υ笫笱芷交〖毎鲋车挠绊?br>　　 1. 目的：
　　 比較大鼠線粒體融合素基因2（Mfn2）和去除穿膜區(qū)序列的線粒體融合素基因2（tMfn2）對大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖的作用，探討tMfn2基因?qū)SMCs增殖的影響及其相關的信號通路。
　　 2.方法：
　　 用攜帶tMfn2基因和Mfn2基因的重組腺病毒（Adv-tMfn2和Adv-

5、Mfn2）感染VSMCs，檢測tMfn2 蛋白和Mfn2 蛋白在細胞中的表達水平；細胞計數(shù)法、四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測VSMCs的增殖；流式細胞儀檢測tMfn2基因?qū)SMCs細胞周期的影響；Western blot方法分析各組磷酸化ERK1/2和磷酸化Raf-1 蛋白表達水平的變化；采用方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。
　　 3.結(jié)果：
　　 Adv-tMfn2和Adv-Mfn2感染VSMCs后能有效表達出相應蛋白

6、；細胞計數(shù)和MTT結(jié)果顯示，tMfn2和Mfn2 均使VSMCs增殖受到明顯抑制（P<0.01），且前者較后者抑制效果更明顯（P<0.01）；流式細胞儀檢測結(jié)果表明tMfn2和Mfn2 使多數(shù)VSMCs 停滯于G0/G1 期，細胞比例為88.01±4.38%和67.43±6.21%，可見tMfn2基因?qū)毎芷诘挠绊懜黠@（P<0.01）；進一步研究表明tMfn2和Mfn2降低VSMCs 磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）和磷酸化R

7、 af-1（p-Raf-1）的表達水平（P<0.01），且tMfn2作用更明顯（P<0.01）。
　　 4.結(jié)論：
　　 與Mfn2基因相比，tMfn2基因更能顯著抑制VSMCs增殖，使細胞周期停滯于G0/G1 期，這一作用主要是通過抑制Ras-Raf-ERK1/2信號通路，下調(diào)磷酸化Raf-1 蛋白表達，進而抑制ERK1/2的磷酸化而實現(xiàn)。
　　 第三部分：tMfn2基因?qū)Υ笫笱芷交〖毎蛲龅挠绊?br>　

8、　 1. 目的：
　　 線粒體融合素基因2（Mfn2）對大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）的增殖和凋亡都有影響，因此推測去除穿膜區(qū)序列的大鼠線粒體融合素基因2（tMfn2）對VSMCs 凋亡可能也有作用，本文進一步探討tMfn2基因?qū)SMCs 凋亡的影響和相關信號通路。
　　 2.方法：
　　 用Adv-tMfn2和Adv-Mfn2 分別感染VSMCs，檢測tMfn2 蛋白和Mfn2 蛋白在細胞中的表達水平。采

9、用流式細胞術、細胞凋亡ELISA、TUNEL 染色等方法檢測tMfn2對VSMCs 凋亡的影響；Western blot 分析磷酸化Akt（p-Akt）蛋白和線粒體凋亡路徑中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-9 蛋白表達變化。
　　 3.結(jié)果：
　　 Adv-tMfn2和Adv-Mfn2感染VSMCs后能有效表達出相應蛋白；流式細胞儀檢測和ELISA結(jié)果表明，tMfn2組的凋亡細胞明顯較Mfn2組增多，

10、且呈時間依賴性，隨著時間的延長，tMfn2 促凋亡作用增強（P＜0.01）；TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)tMfn2組的棕黃色顆粒明顯多于Mfn2組，說明前者促凋亡作用更顯著（P＜0.01）；Western blot結(jié)果顯示，tMfn2和Mfn2組中p-Akt 水平均明顯降低，但前者作用更強（P＜0.01）；
　　 進一步檢測線粒體凋亡路徑中的相關蛋白，tMfn2組的Bax 蛋白表達顯著升高、Bcl-2蛋白表達顯著降低，且cleaved