基因芯片技術(shù)篩選深圳市5歲以下患兒哮喘基因的研究.pdf

1、[目的]
　　1.比較深圳市5歲以下哮喘患兒與對(duì)照組的外周血基因表達(dá)譜差異。
　　2.對(duì)差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分類(lèi)，尋找小兒哮喘易感基因。
　　[方法]
　　于早上同一時(shí)間抽取3ml血液，在2小時(shí)內(nèi)分離淋巴細(xì)胞，并保存于Trizol中，將7例哮喘患兒RNA合并為實(shí)驗(yàn)組，將8例呼吸系統(tǒng)炎癥非哮喘患兒RNA合并為對(duì)照組，冰凍運(yùn)輸至深圳市欣海凌生物科技有限公司，進(jìn)行樣品總RNA提取和純化及RNA、基因芯片的質(zhì)量控制，R

2、NA行逆轉(zhuǎn)錄，標(biāo)記及純化cDNA探針，本研究用cy3標(biāo)記的探針標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組cDNA。
　　NanoDrop ND-1000定量每個(gè)樣本的RNA總量，樣本瓊脂糖凝膠電泳掃描評(píng)估RNA完整性。每個(gè)樣本中有5μ RNA用于標(biāo)記并通過(guò)以下步驟進(jìn)行數(shù)據(jù)雜交:1)反轉(zhuǎn)錄（ds-cDNA合成工具箱）;2）ds-cDNA標(biāo)記（單色DNA標(biāo)記工具箱）;3)數(shù)據(jù)雜交（雜交系統(tǒng)）、洗滌（洗滌緩沖劑工具箱）;4）數(shù)據(jù)掃描（微點(diǎn)陣掃描儀）。掃描后的圖像（TI

3、FF格式）輸入到軟件（版本2.5）中進(jìn)行制表及表達(dá)數(shù)據(jù)的分析。表達(dá)的數(shù)據(jù)經(jīng)RMA(Robust Multichip Average)公式(NimbleScan軟件)標(biāo)準(zhǔn)化，之后產(chǎn)生探針?biāo)胶突蛩降奈募?。所有的基因水平文件均輸入到Agilent GeneSpring GX軟件（版本11.5.1）中行進(jìn)一步的分析。選取信號(hào)值≥50.0的基因作為差異基因進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，通過(guò)聚類(lèi)分析來(lái)揭示標(biāo)本之間可辨識(shí)的基因表達(dá)譜，最后運(yùn)用GO分析和P

4、athway分析用于測(cè)定這些差異表達(dá)基因的作用。
　　[結(jié)果]
　　1.RNA質(zhì)控合格，基因芯片雜交結(jié)果清晰可靠，差異表達(dá)基因的評(píng)估（盒圖、散點(diǎn)圖、聚類(lèi)分析）表明兩組有明顯不同的表達(dá)譜，能很好的區(qū)分。
　　2.本實(shí)驗(yàn)在29890個(gè)基因中，發(fā)現(xiàn)4725個(gè)基因存在差異表達(dá)，其中1660個(gè)表達(dá)上調(diào)，3065個(gè)表達(dá)下調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)過(guò)程中上調(diào)的基因主要涉及生物細(xì)胞過(guò)程、信號(hào)肽及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，下調(diào)的基因則主要涉及各種代

5、謝過(guò)程的調(diào)節(jié);細(xì)胞組分中，上調(diào)的基因偏重于胞外調(diào)節(jié)，而下調(diào)的基因則偏重于胞內(nèi)調(diào)節(jié);分子功能中沒(méi)有明顯的偏重。而Pathway通路分析共發(fā)現(xiàn)有88條通路，其中基因表達(dá)上調(diào)通路有22條，主要包括受體相互作用、腫瘤及黏附等方面，基因表達(dá)下調(diào)通路有66條，主要包括細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子通路及一些免疫系統(tǒng)疾病方面。進(jìn)一步對(duì)這些通路的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)有不少在3條以上的通路富集。
　　[結(jié)論]
　　1.實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)與對(duì)照組相比存在很