蛋白酶體抑制劑硼替佐米對(duì)急性髓性白血病的分化治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:硼替佐米(萬(wàn)珂,Bortezomib/velcade)是一種二肽硼酸衍生物,是第一個(gè)由美國(guó)食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市的蛋白酶體抑制劑,對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的治療具有較高的總體有效率和完全緩解率。Bortezomib抗瘤譜廣,研究表明Bortezomib能誘導(dǎo)急性髓性白血病細(xì)胞(AML)發(fā)生凋亡,且單藥或聯(lián)合其他化療藥物治療白血病均具有一定的臨床療效,但其作用機(jī)制闡釋尚不明確。隨著對(duì)細(xì)胞分化異常在惡性腫瘤發(fā)病學(xué)和治療學(xué)上的意義認(rèn)

2、識(shí)的日益加深,腫瘤的分化治療成為當(dāng)今腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。其中,全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)分化治療急性早幼粒白血病(M3, APL)療法,已列為誘導(dǎo)緩解APL的首選方案之一,但ATRA耐藥、嚴(yán)重毒副反應(yīng)以及復(fù)發(fā)等仍是當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。因此,尋找高效低毒的新型分化誘導(dǎo)劑或?qū)ふ矣行У乃幬锫?lián)用方案是解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵途徑?；诖?本研究探討了Bortezomib單藥或聯(lián)合ATRA在誘導(dǎo)分化治療AML中的藥效及其作用機(jī)制。研究?jī)?nèi)容主要包

3、含了兩個(gè)部分:(1) Bortezomib對(duì)急性髓性白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用及其作用機(jī)制研究;(2) Bortezomib聯(lián)合ATRA對(duì)急性髓性白血病的協(xié)同治療作用,并探究了維甲酸受體RARα通路在該過(guò)程中所發(fā)揮的作用。研究方法:1)選用人白血病細(xì)胞株HL60和U937為主要研究對(duì)象,人原代急性髓性白血病細(xì)胞為輔助研究對(duì)象,考察了Bortezomib對(duì)AML細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用:采用臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)合血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)觀察細(xì)胞增殖情況,描繪細(xì)胞

4、增殖曲線;應(yīng)用吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;采用硝基四氮唑藍(lán)(NBT)測(cè)試細(xì)胞還原能力;細(xì)胞經(jīng)CD14-FITC或CD11b-PE抗體孵育后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原CD14或CD11b表達(dá);應(yīng)用Western blotting檢測(cè)MAPK家族蛋白表達(dá)及活化水平(p-MEK、p-ERK、p-JNK、p-p38、MEK、JNK2、p38),檢測(cè)分化啟動(dòng)因子STAT1表達(dá)及活性水平(p-STAT1 Try701、STAT1);應(yīng)用R

5、ealtime PCR檢測(cè)細(xì)胞STAT1 mRNA表達(dá)水平,并利用CHX抑制蛋白合成研究Bortezomib引起的STAT1蛋白上調(diào)的原因;用攜帶shRNA-STAT1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞,通過(guò)沉默STAT1研究其在Bortezomib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞分化中的關(guān)系。利用MEK特異性抑制劑PD98059、JNK特異性抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580研究MAPK通路在Bortezomib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞分化中的關(guān)

6、系;采用Annexin V-FITC/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定Bortezomib對(duì)AML細(xì)胞的凋亡率及初步探討B(tài)ortezomib誘導(dǎo)的細(xì)胞分化與凋亡的關(guān)系。2)選用人白血病細(xì)胞株HL60和NB4為主要研究對(duì)象,人原代急性髓性白血病細(xì)胞為輔助研究對(duì)象,考察Bortezomib與ATRA對(duì)AML細(xì)胞的聯(lián)合治療作用:采用臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)合血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)觀察細(xì)胞增殖情況和細(xì)胞存活率,描繪細(xì)胞增殖曲線;應(yīng)用吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;采用硝

7、基四氮唑藍(lán)(NBT)測(cè)試細(xì)胞還原能力;細(xì)胞經(jīng)CD11b-PE抗體孵育后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原CDllb表達(dá);采用HL60細(xì)胞裸小鼠移植瘤模型考察Bortezomib與ATRA在體內(nèi)的聯(lián)合治療作用;采用免疫組化法檢測(cè)瘤組織切片C/EBPε的蛋白表達(dá)含量;采用TUNEL法考察瘤組織切片中凋亡情況;應(yīng)用Western blotting檢測(cè)RARα蛋白表達(dá)情況,檢測(cè)相關(guān)分化轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(p-STAT1 Try701、STAT1、c

8、-Myc、C/EBPε、p-27),檢測(cè)MAPK家族蛋白表達(dá)情況(p-MEK、p-JNK);應(yīng)用Realtime PCR檢測(cè)細(xì)胞RARα、STAT1 mRNA表達(dá)水平;采用免疫熒光法檢測(cè)p65和STAT1在細(xì)胞內(nèi)的定位;采用非放射性凝膠遷移法檢測(cè)STAT1與DNA的結(jié)合能力;用慢病毒介導(dǎo)的STAT1 shRNA轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞,通過(guò)沉默STAT1研究其在Bortezomib與ATRA聯(lián)用治療AML中的作用。研究結(jié)果:第一部分:Borte

9、zomib通過(guò)上調(diào)MEK/ERK-JNK p46通路活性,激活STAT1從而誘導(dǎo)AML細(xì)胞向單核/巨噬系細(xì)胞分化。1) Bortezomib具有誘導(dǎo)人急性髓性白血病細(xì)胞向單核/巨噬系細(xì)胞分化成熟的能力。用細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)、分子標(biāo)志等指標(biāo)觀察Bortezomib對(duì)AML細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成熟能力。結(jié)果顯示Bortezomib(5 nM)能誘導(dǎo)人急性髓性白血病(AML)細(xì)胞向單核/巨噬系細(xì)胞分化。Bortezomib(5 n

10、M)可顯著抑制HL60和U937細(xì)胞增殖,第3天的抑制率分別為44.6％和60.6%。吉姆薩染色結(jié)果表明Bortezomib(5 nM)作用72小時(shí)后,HL60細(xì)胞和U937細(xì)胞分化成為幼稚單核細(xì)胞或成熟單核細(xì)胞,形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為胞體變小,核/漿比例下降,細(xì)胞核固縮,部分呈半月核,細(xì)胞中核仁減少或消失。Bortezomib作用后的HL60和U937對(duì)NBT的還原能力增強(qiáng),并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。同時(shí)Bortezomib誘導(dǎo)的分化抗原CD11

11、b/CD14的表達(dá)也呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性關(guān)系。此外,Bortezomib對(duì)人原代急性髓性白血病細(xì)胞(M3-AML, APL)增殖也有顯著的抑制作用,吉姆薩染色表明Bortezomib具有誘導(dǎo)人原代急性髓性白血病細(xì)胞成熟分化的能力。2) Bortezomib誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化成熟的機(jī)制研究Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,Bortezomib能激活MAPK通路(包括MEK/ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)、JNK p46通路和p38通路)

12、,p-MEK、p-ERK、p-JNK p46、p-p38均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性關(guān)系,而其相應(yīng)的原型蛋白表達(dá)水平不變。當(dāng)給予MEK特異性抑制劑PD98059或JNK特異性抑制劑SP600125時(shí),Bortezomib引起的MEK、ERK或JNK p46的活化被抑制,同時(shí)CDl4和CD11b的表達(dá)分別從Bortezomib單藥組的27.3%和35.8%下降到對(duì)照組水平。此外,PD98059同時(shí)抑制了Bortezomib引起的JNK

13、 p46的活化,但SP600125對(duì)MEK活性無(wú)影響。當(dāng)給與p38特異性抑制劑SB203580時(shí),Bortezomib誘導(dǎo)的CD14和CD11B的表達(dá)率為42.6%和56.0%,提示了p38可能對(duì)Bortezomib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞的分化起到負(fù)調(diào)控作用。以上結(jié)果證明了MEK/ERK-JNK通路參與介導(dǎo)Bortezomib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞分化。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明,Bortezomib誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因

14、子STAT1的蛋白水平與活性形式pSTAT1 Tyr701均呈時(shí)間依賴性上調(diào)。Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果表明STAT1 mRNA的表達(dá)也呈時(shí)間依賴性增加。給與CHX抑制STAT1 mRNA的表達(dá),Bortezomib作用后,STAT1蛋白水平仍有所上調(diào),提示Bortezomib同時(shí)抑制了STAT1蛋白的降解。此外我們也觀察到STAT1下游基因C/EBPα蛋白的上調(diào)。慢病毒介導(dǎo)的shRNA-STAT1顯著下調(diào)了HL60細(xì)胞中的STA

15、T1蛋白水平,Bortezomib作用于shRNA空載轉(zhuǎn)染的HL60細(xì)胞72小時(shí)后,CD14和CD11B的表達(dá)率分別為20.4%和39.6%,而在shRNA-STAT1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,Bortezomib誘導(dǎo)的CD14和CD11b僅為10.1%和19.6%。給與PD98059或SP600125抑制Bortezomib引起的HL60細(xì)胞分化的同時(shí),觀察到STAT1水平上調(diào)被抑制,活性水平被抑制,C/EBPa表達(dá)也受到抑制。上述結(jié)果表明Bor

16、tezomib激活的MEK/ERK-JNK通路可能通過(guò)進(jìn)一步激活分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STAT1誘導(dǎo)AML細(xì)胞的分化。3) Bortezomib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞分化與凋亡為RARα非依賴的過(guò)程。Western blotting結(jié)果顯示,Bortezomib作用于HL60后,維甲酸受體RARa蛋白水平增加,但通過(guò)雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示,RARa轉(zhuǎn)錄活性無(wú)顯著變化。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明Bortezomib能誘導(dǎo)RARa突變的HL60

17、R細(xì)胞分化抗原CD11b的表達(dá)及凋亡的發(fā)生。以上結(jié)果提示Bortezomib誘導(dǎo)AML細(xì)胞的分化與凋亡是RARα非依賴的過(guò)程。4) Bortezomib誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的同時(shí),伴隨著AML細(xì)胞的凋亡,并初步探討B(tài)ortezomib引起的AML細(xì)胞分化與凋亡之間的關(guān)系。Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,5 nM Bortezomib在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的同時(shí),伴隨了時(shí)間依賴性的細(xì)胞凋亡。但由MEK/ERK-JNK通路的

18、抑制引起的Bortezomib細(xì)胞分化的抑制過(guò)程中,Bortezomib引起的細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性變化。由此推測(cè),Bortezomib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞的分化與凋亡可能是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程。第二部分:Bortezomib通過(guò)抑制ATRA引起的RARa蛋白的降解,協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞粒性分化。1) Bortezomib協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞粒性分化。MTT檢測(cè)法顯示Bortezomib與ATRA聯(lián)合作用能協(xié)同抑制HL60與NB4細(xì)胞

19、的增殖。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法,計(jì)數(shù)并繪制Bortezomib與ATRA聯(lián)合作用后的細(xì)胞的增殖曲線和存活率曲線。結(jié)果顯示Bortezomib(在HL60細(xì)胞上選用濃度2.5 nM,在NB4細(xì)胞上選用濃度2.5、5 nM)單藥作用不影響細(xì)胞的存活率和細(xì)胞增殖能力,但能顯著增強(qiáng)ATRA引起的細(xì)胞增殖抑制作用,而這種作用并不是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡實(shí)現(xiàn)的。我們從形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)及分子標(biāo)志三方面指標(biāo)證實(shí)了Bortezomib能促進(jìn)ATRA誘

20、導(dǎo)的HL60、NB4細(xì)胞的分化,具體表現(xiàn)為與ATRA單用組相比,藥物聯(lián)用組引起的核分葉比例顯著增加,NBT還原能力顯著增強(qiáng),分化抗原CDllb表達(dá)量顯著增加。在人原代白血病細(xì)胞上,ATRA與Bortezomib也具有協(xié)同作用。在M3-AML型、AML/ALL混合型、AML-resistance型三個(gè)原代病人骨髓中分離得到原代白血病。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)或CCK8檢測(cè),結(jié)果顯示兩藥聯(lián)合作用后細(xì)胞存活率顯著低于單用組。在M3-AML型原代病人樣本上

21、,Bortezomib增強(qiáng)了ATRA引起的細(xì)胞NBT還原能力。2) Bortezomib聯(lián)合ATRA通過(guò)誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化,抑制裸小鼠HL60移植瘤的生長(zhǎng)。裸小鼠HL60人白血病細(xì)胞移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ATRA(5 mg/kg)組及Bortezomib(0.1 mg/kg)組均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用,其T/C%值分別為58.0%和62.0%,抑瘤率分別為40.0%和20.0%,聯(lián)合作用組T/C%值和抑瘤率分別為45%和58.9%,說(shuō)明

22、Bortezomib與ATRA在體內(nèi)也有較好抗腫瘤協(xié)同作用。通過(guò)分離得到瘤組織單細(xì)胞懸液,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),顯示聯(lián)用組瘤組織中分化抗原CD11b的表達(dá)率為53.1%,顯著高于ATRA單用組(40.4%)和Bortezomib單用組(38.6%)。從免疫組化結(jié)果也得出類似的結(jié)果,在聯(lián)用組中C/EBPε的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組與單藥組。此外,采用TUNEL染色檢測(cè)了瘤組織中的凋亡情況,顯示該劑量配比下,瘤組織中幾乎檢測(cè)不到凋亡的發(fā)生。3)

23、Bortezomib協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的機(jī)制研究20S蛋白酶體活性檢測(cè)結(jié)果表明,蛋白酶體活性在ATRA誘導(dǎo)的HL60和NB4細(xì)胞分化過(guò)程中明顯上調(diào),Bortezomib顯著抑制了這一上調(diào)現(xiàn)象。與之對(duì)應(yīng)的,在ATRA誘導(dǎo)的HL60和NB4細(xì)胞分化過(guò)程中RARα蛋白經(jīng)泛素蛋白酶體通路介導(dǎo)呈下調(diào)趨勢(shì),Bortezomib與ATRA聯(lián)合作用后,RARα蛋白得以累積,而其mRNA水平無(wú)顯著性變化。RARα與維甲酸反應(yīng)元件RARE結(jié)合能

24、直接介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子STAT1的表達(dá)。ATRA能誘導(dǎo)STAT1的表達(dá),Bortezomib與ATRA聯(lián)合作用后,STAT1 mRNA水平顯著增加。以上結(jié)果提示了Bortezomib抑制了ATRA引起的RARα蛋白的降解,增強(qiáng)了RARα轉(zhuǎn)錄活性。Western blotting檢測(cè)瘤組織中RARα蛋白的表達(dá)含量,結(jié)果顯示Bortezomib抑制了ATRA引起的RARα蛋白的降解,聯(lián)用組中RARα蛋白含量顯著高于ATRA單用組。Western

25、blotting結(jié)果顯示ATRA上調(diào)了STAT1蛋白水平和Tyr701位點(diǎn)磷酸化水平,Bortezomib與ATRA聯(lián)合作用進(jìn)一步上調(diào)STAT1的蛋白水平和活性,而該濃度Bortezomib單獨(dú)作用對(duì)其無(wú)顯著影響。免疫熒光結(jié)果顯示合用組細(xì)胞核中STAT1的分布顯著增加,EMSA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)提示了STAT1與DNA結(jié)合能力顯著增加。慢病毒介導(dǎo)的shRNA-STAT1顯著下調(diào)了HL60細(xì)胞中的STAT1蛋白水平,同時(shí)部分逆轉(zhuǎn)了Bort

26、ezomib對(duì)ATRA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化的協(xié)同作用。以上結(jié)果顯示STAT1參與了Bortezomib協(xié)同ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化的過(guò)程。免疫熒光結(jié)果顯示,p65在ATRA單用組、與Bortezomib聯(lián)用組細(xì)胞中的分布無(wú)顯著性差異。此外,ATRA或Bortezomib單用組中MEK活性增強(qiáng),但聯(lián)用組與單用組MEK活性無(wú)顯著性差別。JNK通路活性在ATRA與Bortezomib聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞分化過(guò)程中變化不大。以上結(jié)果顯示了NFκB通路與MEK.

27、JNK通路在Bortezomib協(xié)同ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過(guò)程中不起關(guān)鍵性作用。結(jié)論:本論文較為系統(tǒng)地研究了Bortezomib誘導(dǎo)或促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化治療中的作用,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。高濃度Bortezomib通過(guò)激活MEK/ERK-JNK通路啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子STAT1介導(dǎo)的AML細(xì)胞的單核/巨噬系分化。低濃度Bortezomib可以通過(guò)抑制ATRA引起的RARa的泛素化降解,提高RARa的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而促進(jìn)了STAT1