蛋白酶體抑制劑硼替佐米的抗急性T淋巴細胞白血病作用的實驗研究.pdf

1、一、蛋白酶體抑制劑硼替佐米對具有Notch1突變的急性T淋巴細胞白血病細胞株生長和凋亡的影響及其機制的研究
　　 目的：觀察蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib,Bor)在體外對具有Notch1突變的急性T淋巴細胞白血病細胞株MOLT-4細胞生長、凋亡和周期的影響并進一步研究其可能的作用機制。
　　 方法：苔盼蘭活細胞計數(shù)法檢測細胞增殖；CCK-8法檢測細胞活性；Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡；PI染

2、色分析細胞周期；RT-PCR法檢測NF-κB(p65)、Notch1下游靶基因Hes1 mRNA的表達。
　　 結(jié)果：硼替佐米對急性T淋巴細胞白血病細胞的增殖抑制作用與硼替佐米的劑量直線相關(guān)；并呈劑量、時間依賴性；硼替佐米能誘導(dǎo)MOLT-4凋亡，且誘導(dǎo)細胞凋亡比例呈時間、劑量依賴性；隨著硼替佐米濃度的增加，G1期細胞比率逐漸增加，S期逐漸減少；硼替佐米處理后，NF-κB、Hes1 mRNA的表達明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：硼

3、替佐米能通過抑制Notch1活性，同時抑制NF-κB的表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制MOLT-4細胞的增殖和生長，同時導(dǎo)致細胞周期G1期阻滯。
　　 二、硼替佐米對MoLT-4白血病細胞移植瘤裸鼠的抗腫瘤作用及其機制的研究
　　 目的：研究蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib,Bor)對具有Notch1突變的急性T淋巴細胞白血病細胞株MOLT-4細胞移植瘤裸鼠的抗腫瘤作用及其可能的機制。
　　 方法：6周齡

4、雌性Balb/C裸鼠接種前3天起腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)，連續(xù)2天。隔天在裸鼠右臀皮下接種0.2ml密度為5×107/ml的MOLT-4細胞，接種后干預(yù)組分別于(+1d、+4d、+8d、+11d)腹腔內(nèi)注射硼替佐米，對照組注射同樣劑量的生理鹽水。觀察瘤體生長情況，第64d脫頸處死裸鼠，觀察脾臟以及右側(cè)腋窩淋巴結(jié)大小，剝離皮下腫瘤并稱重，將剝離腫瘤置于10％的中性福爾馬林中固定24h，石蠟包埋、切片，作H-E染色。將剝離腫瘤制成細胞懸液

5、，分析腫瘤細胞染色體；RT-PCR法分析Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1基因表達變化；Western印跡檢測NF-κB、Hes1、Caspase3、Caspase9表達變化。
　　 結(jié)果：MOLT-4細胞接種后在裸鼠皮下均成瘤，腹腔用藥后觀察，對照組明顯可見的腫瘤形成時間為3周，而硼替佐米組明顯成瘤時間約延遲至4周。硼替佐米可明顯抑制MOLT-4細胞在裸鼠體內(nèi)的生長，硼替佐米組瘤體體積增長

6、速度顯著低于對照組，+60天硼替佐米組的移植瘤的體積和重量分別為977.53±475.69mm3和2266.23±376.48mg，對照組的移植瘤體積和重量分別為2850.48±101.84mm3和3678.7±1084.15mg,均顯著低于對照組(P＜0.01)。且對照組裸鼠右側(cè)腋窩淋巴結(jié)以及脾臟均較硼替佐米組明顯增大。染色體分析與原代MOLT-4細胞無明顯變化；HE染色顯示：硼替佐米組的腫瘤細胞出現(xiàn)明顯細胞分化、凋亡等形態(tài)學(xué)改變，并

7、可形成凋亡小體。硼替佐米可以下調(diào)移植瘤細胞Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1 mRNA的表達；Western結(jié)果顯示硼替佐米組NF-κB、Hes1蛋白表達均較對照組明顯下降，而Caspase3、Caspase9蛋白的表達均較對照組明顯增加。
　　 結(jié)論：硼替佐米在體內(nèi)環(huán)境中也能發(fā)揮抑制急性T淋巴細胞白血病細胞的增殖和生長作用。同時也能抑制白血病細胞在體內(nèi)的組織浸潤轉(zhuǎn)移能力。除了通過誘導(dǎo)MOL

8、T-4細胞的凋亡之外，通過抑制MOLT-4細胞NF-κB的表達以及抑制Notch1活化也是其抗腫瘤作用的重要機制之一。硼替佐米不改變MOLT-4細胞的遺傳學(xué)特征。
　　 三、硼替佐米對過表達Notch1胞內(nèi)段(ICN1)誘發(fā)的急性T淋巴細胞白血病小鼠生存的改善及其作用機制的研究
　　 目的：研究蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib,Bor)對過表達Notch1胞內(nèi)段(ICN1)誘發(fā)的急性T淋巴細胞白血病小鼠的抗白

9、血病作用及其可能的機制
　　 方法：以過表達Notch1胞內(nèi)段(ICN1-GFP)的小鼠急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)為模型，隨機分為對照(PBS)組和Bor組，觀察兩組小鼠生存狀況；流式細胞檢測硼替佐米組以及對照組小鼠外周血及骨髓白血病細胞的比率變化，并對白血病小鼠肝脾行病理及免疫組化檢測；RT-PCR法分析骨髓白血病細胞Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1基因表達變化，Western印

10、跡檢測NF-κB、Hes1、Caspase3、Caspase9表達變化。
　　 結(jié)果：對照組小鼠在移植后21天大部分死亡，死亡前表現(xiàn)出明顯的惡病質(zhì)、弓背以及活動量的減少，而硼替佐米處理組小鼠白血病進展較對照組明顯減漫、生存時間延長(P=0.0172)；硼替佐米組小鼠外周血及骨髓細胞中ICN1-GFP的表達率明顯低于對照組，硼替佐米組小鼠肝脾白血病細胞浸潤較對照組明顯減少，而Caspase3、Caspase9表達增加，Notch1

11、、NF-κB表達明顯下降；硼替佐米可以下調(diào)骨髓白血病細胞Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1 mRNA的表達；Western結(jié)果顯示硼替佐米組NF-κB、Hes1蛋白表達均較對照組明顯下降，而Caspase3、Caspase9蛋白的表達均較對照組明顯增加。
　　 結(jié)論：硼替佐米可明顯改善過表達ICN1的T-ALL小鼠生存，主要通過抑制白血病細胞在小鼠各臟器的浸潤以及誘導(dǎo)白血病細胞的凋亡，從而起