蛋白酶體抑制劑硼替佐米的抗急性T淋巴細(xì)胞白血病作用的實驗研究.pdf

1、一、蛋白酶體抑制劑硼替佐米對具有Notch1突變的急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株生長和凋亡的影響及其機(jī)制的研究
　　 目的：觀察蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib,Bor)在體外對具有Notch1突變的急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株MOLT-4細(xì)胞生長、凋亡和周期的影響并進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：苔盼蘭活細(xì)胞計數(shù)法檢測細(xì)胞增殖；CCK-8法檢測細(xì)胞活性；Annexin-V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡；PI染

2、色分析細(xì)胞周期；RT-PCR法檢測NF-κB(p65)、Notch1下游靶基因Hes1 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：硼替佐米對急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖抑制作用與硼替佐米的劑量直線相關(guān)；并呈劑量、時間依賴性；硼替佐米能誘導(dǎo)MOLT-4凋亡，且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡比例呈時間、劑量依賴性；隨著硼替佐米濃度的增加，G1期細(xì)胞比率逐漸增加，S期逐漸減少；硼替佐米處理后，NF-κB、Hes1 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：硼

3、替佐米能通過抑制Notch1活性，同時抑制NF-κB的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制MOLT-4細(xì)胞的增殖和生長，同時導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯。
　　 二、硼替佐米對MoLT-4白血病細(xì)胞移植瘤裸鼠的抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究
　　 目的：研究蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib,Bor)對具有Notch1突變的急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株MOLT-4細(xì)胞移植瘤裸鼠的抗腫瘤作用及其可能的機(jī)制。
　　 方法：6周齡

4、雌性Balb/C裸鼠接種前3天起腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)，連續(xù)2天。隔天在裸鼠右臀皮下接種0.2ml密度為5×107/ml的MOLT-4細(xì)胞，接種后干預(yù)組分別于(+1d、+4d、+8d、+11d)腹腔內(nèi)注射硼替佐米，對照組注射同樣劑量的生理鹽水。觀察瘤體生長情況，第64d脫頸處死裸鼠，觀察脾臟以及右側(cè)腋窩淋巴結(jié)大小，剝離皮下腫瘤并稱重，將剝離腫瘤置于10％的中性福爾馬林中固定24h，石蠟包埋、切片，作H-E染色。將剝離腫瘤制成細(xì)胞懸液

5、，分析腫瘤細(xì)胞染色體；RT-PCR法分析Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1基因表達(dá)變化；Western印跡檢測NF-κB、Hes1、Caspase3、Caspase9表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：MOLT-4細(xì)胞接種后在裸鼠皮下均成瘤，腹腔用藥后觀察，對照組明顯可見的腫瘤形成時間為3周，而硼替佐米組明顯成瘤時間約延遲至4周。硼替佐米可明顯抑制MOLT-4細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長，硼替佐米組瘤體體積增長

6、速度顯著低于對照組，+60天硼替佐米組的移植瘤的體積和重量分別為977.53±475.69mm3和2266.23±376.48mg，對照組的移植瘤體積和重量分別為2850.48±101.84mm3和3678.7±1084.15mg,均顯著低于對照組(P＜0.01)。且對照組裸鼠右側(cè)腋窩淋巴結(jié)以及脾臟均較硼替佐米組明顯增大。染色體分析與原代MOLT-4細(xì)胞無明顯變化；HE染色顯示：硼替佐米組的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞分化、凋亡等形態(tài)學(xué)改變，并

7、可形成凋亡小體。硼替佐米可以下調(diào)移植瘤細(xì)胞Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1 mRNA的表達(dá)；Western結(jié)果顯示硼替佐米組NF-κB、Hes1蛋白表達(dá)均較對照組明顯下降，而Caspase3、Caspase9蛋白的表達(dá)均較對照組明顯增加。
　　 結(jié)論：硼替佐米在體內(nèi)環(huán)境中也能發(fā)揮抑制急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖和生長作用。同時也能抑制白血病細(xì)胞在體內(nèi)的組織浸潤轉(zhuǎn)移能力。除了通過誘導(dǎo)MOL

8、T-4細(xì)胞的凋亡之外，通過抑制MOLT-4細(xì)胞NF-κB的表達(dá)以及抑制Notch1活化也是其抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。硼替佐米不改變MOLT-4細(xì)胞的遺傳學(xué)特征。
　　 三、硼替佐米對過表達(dá)Notch1胞內(nèi)段(ICN1)誘發(fā)的急性T淋巴細(xì)胞白血病小鼠生存的改善及其作用機(jī)制的研究
　　 目的：研究蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib,Bor)對過表達(dá)Notch1胞內(nèi)段(ICN1)誘發(fā)的急性T淋巴細(xì)胞白血病小鼠的抗白

9、血病作用及其可能的機(jī)制
　　 方法：以過表達(dá)Notch1胞內(nèi)段(ICN1-GFP)的小鼠急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)為模型，隨機(jī)分為對照(PBS)組和Bor組，觀察兩組小鼠生存狀況；流式細(xì)胞檢測硼替佐米組以及對照組小鼠外周血及骨髓白血病細(xì)胞的比率變化，并對白血病小鼠肝脾行病理及免疫組化檢測；RT-PCR法分析骨髓白血病細(xì)胞Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1基因表達(dá)變化，Western印

10、跡檢測NF-κB、Hes1、Caspase3、Caspase9表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：對照組小鼠在移植后21天大部分死亡，死亡前表現(xiàn)出明顯的惡病質(zhì)、弓背以及活動量的減少，而硼替佐米處理組小鼠白血病進(jìn)展較對照組明顯減漫、生存時間延長(P=0.0172)；硼替佐米組小鼠外周血及骨髓細(xì)胞中ICN1-GFP的表達(dá)率明顯低于對照組，硼替佐米組小鼠肝脾白血病細(xì)胞浸潤較對照組明顯減少，而Caspase3、Caspase9表達(dá)增加，Notch1

11、、NF-κB表達(dá)明顯下降；硼替佐米可以下調(diào)骨髓白血病細(xì)胞Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1 mRNA的表達(dá)；Western結(jié)果顯示硼替佐米組NF-κB、Hes1蛋白表達(dá)均較對照組明顯下降，而Caspase3、Caspase9蛋白的表達(dá)均較對照組明顯增加。
　　 結(jié)論：硼替佐米可明顯改善過表達(dá)ICN1的T-ALL小鼠生存，主要通過抑制白血病細(xì)胞在小鼠各臟器的浸潤以及誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡，從而起