白藜蘆醇聯(lián)合蛋白酶體抑制劑對白血病的治療作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　 白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性病變,其主要表現(xiàn)為異常的白血病細胞及其幼稚細胞在骨髓及其他造血組織中進行性的異常增生,發(fā)病機制目前尚不完全明確。
　　 泛素.蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是真核生物體內(nèi)進行蛋白選擇性降解的主要通路。由UPS介導的蛋白質(zhì)降解通路的嚴密調(diào)控在細胞周期中蛋白質(zhì)半衰期的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、抗原提呈、血管發(fā)生、以及移除錯誤折疊或受損的蛋白質(zhì)等過程中均發(fā)揮重要作用。研究表明,蛋白酶體抑制劑通過對泛素化通

2、路的阻斷可誘導多種包括白血病的人類腫瘤的細胞凋亡,是一類很有發(fā)展前途的抗腫瘤藥物。
　　 由于人工合成的化療藥物在治療腫瘤方面存在局限性,近年來一些從植物中提取的天然抗腫瘤藥物得到了科研界、醫(yī)療界的廣泛關注。白藜蘆醇是富含于葡萄皮、花生、紅酒等中的一種天然多酚類化合物,白藜蘆醇在抗腫瘤、抗炎、肝臟保護、神經(jīng)保護、心血管保護和免疫調(diào)節(jié)等方面均發(fā)揮重要作用。已有大量報道表明,單獨應用大劑量(通常大于50μmol/L)的白藜蘆醇能夠抑

3、制人類腫瘤細胞的生長。另外已有報道,白藜蘆醇聯(lián)合某些化療藥物治療腫瘤,不僅能夠降低化療藥物的毒副作用,而且能夠增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。本研究探討蛋白酶體抑制劑單獨及聯(lián)合白藜蘆醇在白血病細胞凋亡過程中的影響作用。
　　 方法：
　　 1、單獨使用MG132或聯(lián)合白藜蘆醇處理白血病細胞
　　 2、MTT法檢測細胞活力
　　 3、流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期
　　 4、蛋白印跡法檢測蛋白PA

4、RP剪切水平
　　 5、實時定量PCR和蛋白印跡法檢測p27Kipl和FOXO1的表達水平
　　 6、染色質(zhì)免疫沉淀法檢測結合到p27Kipl啟動子的FOXO1水平
　　 結果：
　　 一、白藜蘆醇能夠?qū)筂G132對K562的細胞毒性效應
　　 MTT結果顯示1-20μmol/L的白藜蘆醇對K562細胞活力無影響,而大于50μmol/L能使細胞活力明顯下降;K562細胞活力對MG132呈劑量依賴

5、性下降;白藜蘆醇能夠?qū)筂G132呈劑量依賴性誘導的細胞活力變化,2μmol/L具有明顯的抑制效應,5-20μmol/L顯示出最大效應;即使選用毒性劑量(50-100μmol/L)的白藜蘆醇仍然能夠有效對抗MG132的細胞毒性。AnnexinV/PI雙染證實MG132能夠明顯誘導K562細胞凋亡,100μmol/L白藜蘆醇單獨處理K562細胞24h僅誘導了12%的細胞凋亡;聯(lián)合白藜蘆醇能夠明顯對抗MG132誘導的細胞凋亡。Western

6、Blot顯示,聯(lián)合白藜蘆醇能夠明顯的抑制由MG132誘導的PARP剪切成89kDa片段。
　　 二、白藜蘆醇能夠降低蛋白酶體抑制劑對白血病細胞的毒性效應
　　 流式AnnexinV/PI雙染結果顯示,白藜蘆醇同樣能夠?qū)筂G132對NB4,U937,Daudi和Raji細胞凋亡作用,三種不同結構的蛋白酶體抑制劑(PSI,lactacystin,epoxomicin)能夠誘導K562細胞凋亡40-60%;同時5μmol/L

7、白藜蘆醇對三種不同結構的蛋白酶體抑制劑都有明顯的對抗作用。
　　 三、白藜蘆醇對抗MG132誘導的細胞毒性效應過程中涉及到p27Kipl介導的G1/S阻滯
　　 使用5μmol/L白藜蘆醇、5μmol/LMG132分別處理K562,NB4,U937,Daudi和Raji細胞24h后,流式PI單染結果顯示前者S期細胞數(shù)增加,后者S期和G2/M期細胞數(shù)均增加。與MG132單獨作用相比,聯(lián)合白藜蘆醇之后S期細胞數(shù)降低,而G1期

8、細胞數(shù)增加。Westernblot顯示,與對照組相比,白藜蘆醇、MG132單獨作用于K562細胞,均增加了p27Kipl的表達,二者聯(lián)合使用時更多地增加了p27Kipl的表達。與對照組相比,敲低p27Kipl后微弱地對抗了MG132單獨誘導的細胞凋亡,重要的是,在p27Kipl敲低細胞中白藜蘆醇對MG132作用的拮抗明顯削弱。四、白藜蘆醇和MG132通過FOXO1誘導p27Kipl上調(diào)
　　 實時定量PCR顯示,單獨使用白藜蘆醇

9、促進mRNA水平p27Kipl表達增加,而MG132對其無明顯作用。兩者聯(lián)合使用,更能顯著地增加mRNA水平p27Kipl的表達。首先用RNA合成的抑制荊放線菌酮D預處理細胞,然后使用白藜蘆醇單獨或聯(lián)合MG132,結果顯示放線菌酮D在兩種處理方式中完全阻滯了p27KiplmRNAT水平的上調(diào)。實時定量PCR和Westernblot結果顯示,與vehicle或MG132處理組相比,白藜蘆醇單獨或聯(lián)合MG132處理組都能明顯增加FOXO1的

10、表達。ChIP實驗發(fā)現(xiàn)與單獨使用白藜蘆醇相比,白藜蘆醇聯(lián)合MG132處理后結合到p27Kipl啟動子的FOXO1明顯增多。采用siRNA敲低FOXO1后,Westernblot結果顯示明顯抑制了白藜蘆醇誘導的FOXO1表達。重要的是,由白藜蘆醇誘導的p27Kipl的表達也明顯被抑制。
　　 結論：
　　 1、白藜蘆醇可能通過調(diào)節(jié)FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性和p27Kipl的募集從而對抗蛋白酶體抑制劑的細胞毒性效應。