引流淋巴結在異體復合組織移植中的作用研究.pdf

1、近年來，隨著免疫抑制藥物的不斷發(fā)展和聯(lián)合免疫抑制方案的不斷進步，臨床器官移植取得了巨大的成功，含有皮膚的同種異體復合組織移植（CTA）也進行了初步的嘗試，并取得良好的效果。但是，終身使用免疫抑制藥物帶來的各種毒副作用延緩了CTA的進一步發(fā)展。在更好的免疫抑制藥物出現之前，如何降低現有免疫抑制藥物的全身使用劑量成為研究的熱點。而帶有皮膚的CTA多位于體表，易于觀察和干預，因此，有效的局部免疫抑制有望降低全身免疫抑制用藥量。
　　移植

2、免疫反應是以T細胞適應性免疫應答為主。血循環(huán)中的初始T細胞在次級淋巴組織與載有抗原的抗原提呈細胞（APCs）經過反復接觸、識別，初始T細胞逐漸成熟，并增殖成為效應T細胞，再次進入血液循環(huán)，到達異體移植物局部后，促使移植物發(fā)生排斥反應。CTA的發(fā)展之所以滯后于器官移植，是因為皮膚的強免疫源性，因此解決了皮膚的移植排斥反應將推動CTA的發(fā)展。而皮膚移植物的異體抗原被APCs攝取后，只能沿著淋巴引流進入引流淋巴結，很難有大量的抗原通過血液進入

3、脾或其他部位的淋巴結。因此，如果能夠有效的干預引流淋巴結，就可能顯著減少效應T細胞的產生，減輕移植物的排斥反應，進而降低免疫抑制藥物的全身用藥量，減少毒副作用。因此，本研究擬針對引流淋巴結在CTA中的作用進行研究。
　　實驗一：大鼠淋巴結解剖及異體移植模型的選擇
　　目的：通過大鼠全身淋巴結的解剖，各部位引流淋巴結的確定，對比研究各種移植模型的引流淋巴結，為淋巴結干預研究選擇適當的移植模型。方法：對SD封閉群、Lewis近交

4、系大鼠分別進行全身淋巴結解剖，記錄淋巴結的全身分布位置、形態(tài)特征、數量、重量及單位重量細胞濃度，比較不同品系間、不同體重大鼠間淋巴結重量、單位重量細胞濃度的差異；大鼠備選皮瓣局部皮下注射美蘭，解剖大鼠，定位染色的引流淋巴結；通過分析比較不同移植模型的解剖及引流淋巴結確定本實驗移植模型。結果：2個品系大鼠淋巴結的分布基本明確，無明顯變異，數量、重量恒定，SD封閉群大鼠淋巴結較Lewis大鼠略重，淋巴結重量隨大鼠體重的增加而增加。經顏面部、

5、側胸、下腹部皮瓣引流淋巴結的確定及三種皮瓣手術難度的評估，確定以下腹部皮瓣為最佳，選定為本研究移植模型。并成功建立下腹部游離皮瓣移植模型，并通過術后淋巴結的解剖驗證了下腹部游離皮瓣的引流淋巴結的部位。結論：下腹部皮瓣的引流淋巴結為對側腹股溝淋巴結、同側腋固有淋巴結、同側髂內淋巴結，該皮瓣移植模型是淋巴結干預實驗的最佳移植模型。
　　實驗二：雷帕霉素腹腔注射對大鼠異體皮瓣移植的作用
　　目的：通過雷帕霉素腹部注射對大鼠腹部皮瓣

6、存活的影響研究確定雷帕霉素的最低有效免疫抑制劑量。方法：以BN大鼠為供體、Lewis大鼠為受體，進行下腹部游離皮瓣異體移植；將雷帕霉素原料藥配置成1mg/mL的雷帕霉素腹腔注射劑，根據雷帕霉素使用劑量8、4、2、1、0mg/kg/day分為A、B、C、D、E5組，用藥時間-1—7天；觀察各組皮瓣存活時間、存活質量、病理表現，確定雷帕霉素最低有效免疫抑制劑量。結果：總實驗例數36例，有效例數29例。各組大鼠平均存活時間分別為17.3±1.

7、7天（A組）、17.5±1.7天（B組）、14.2±1.3天（C組）、7.3±0.6天（D組）、7.3±0.5天（E組）。結論：選擇2mg/kg/day雷帕霉素劑量作為最低有效免疫抑制劑量。
　　實驗三：去除引流淋巴結對大鼠異體皮瓣存活的影響
　　目的：通過去除大鼠下腹部皮瓣的引流淋巴結，確定其對皮瓣存活的影響。方法：BN大鼠為供體、Lewis大鼠為受體，將大鼠隨機分為5組，A組：移植術前2周開腹假手術對照；B組：移植術前2

8、周開腹假手術，雷帕霉素2mg/kg/day全身用藥（－1～7天）；C組：移植術前2周去除引流淋巴結；D組：移植術前2周去除引流淋巴結及脾；E組：移植術前2周去除引流淋巴結，雷帕霉素2mg/kg/day全身用藥（－1～7天）。術后通過觀察動物存活率、皮瓣平均存活時間、血清IL-2水平等指標評價去除引流淋巴結對皮瓣存活的影響。對移植前2周，移植同時、移植后3天不同時間去除引流淋巴結對皮瓣存活時間的影響也進行了研究。結果：各組的平均存活時間分

9、別為7.3±0.5天（A組），14.4±0.3天（B組），9.5±1.0天（C組），8.8±0.8天（D組）、17.0±1.9天（E組）。B、E組血清IL-2水平明顯低于A、C、D組；C、D組的IL-2水平比A組略高。術前14天、術中、術后3天不同時間去除引流淋巴結，移植后皮瓣存活天數無明顯差異。結論：去除引流淋巴結可以延長皮瓣平均存活時間，結合低劑量雷帕霉素免疫抑制可以延長皮瓣存活時間。
　　實驗四：淋巴結、淋巴引流在移植免疫中

10、的機制研究
　　目的：通過研究淋巴結對異體移植物的反應、阻斷淋巴引流對移植物存活的影響，探討淋巴結、淋巴引流在移植免疫中的機制。方法：BN為供體、Lewis為受體，下腹部異體皮瓣移植術后1、3、5、7、9天不同時間解剖淋巴結，同Lewis自體分離腹部皮瓣保留血管蒂再縫合回去作為對照，對兩組大鼠不同時間摘取的引流淋巴結和非引流淋巴結進行稱重、細胞計數、流式細胞分析CD4+CD25+細胞的變化，分析引流淋巴結在異體移植后的動態(tài)變化。對

11、去除引流淋巴結的Lewis大鼠進行BN下腹部游離皮瓣移植后，獲取非引流淋巴結，觀察其大體變化、重量變化、細胞計數、流式細胞分析來判斷非引流淋巴結是否受異體移植物的影響。建立SD→SD、BN→Lewis的隔離皮膚或不隔離皮膚的皮管移植模型，通過阻斷皮膚淋巴引流觀察皮管存活時間及質量。結果：移植后的引流淋巴結逐漸充血、腫大、重量增加，細胞密度增高，流式細胞分析發(fā)現CD4+CD25+細胞較非引流淋巴結增多。異體移植及單純炎癥均可導致引流淋巴結

12、重量增加、單位重量細胞濃度增加，但移植導致淋巴結重量的增加高于炎癥所致，單位重量細胞濃度無明顯差別，但較兩組的分引流淋巴結均有明顯差別。去除引流淋巴結后移植術后，非引流淋巴結未發(fā)現明顯充血及腫大。隔絕皮膚淋巴引流的SD→SD皮管移植物最長存活至32天，未隔絕供、受體皮膚接觸的SD→SD及兩組BN→Lewis的皮管移植均未能長期存活。結論：引流淋巴結是同種異體移植后主要反應部位，隔絕皮膚淋巴引流供、受體間在較小的MHC差異下可明顯延長異體