NF-кB、P38MAPK在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞肝向分化過(guò)程中的機(jī)制研究.pdf

1、目的：探究信號(hào)傳導(dǎo)分子核因子-кB（NF-кB）和P38MAPK在參與調(diào)控肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)為誘導(dǎo)劑的條件下體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）向肝樣細(xì)胞定向分化的進(jìn)程中，NF-кB信號(hào)通路和P38MAPK信號(hào)通路對(duì)分化的調(diào)控是否存在著某種聯(lián)系。P38MAPK作為NF-кB的上游通路，在分化的過(guò)程中是參與了NF-кB的激活。

2、r>　　方法：本實(shí)驗(yàn)中所用到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于四周齡的雄性SD大鼠。細(xì)胞的獲取通過(guò)采用全骨髓貼壁法，利用不同細(xì)胞貼壁時(shí)間的差異，篩選出所需要的目標(biāo)細(xì)胞。分離后的細(xì)胞在含10％胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，第一次換液為全換液，可以使得培養(yǎng)瓶中的大部分還沒(méi)有貼壁或者貼壁不牢的非目的細(xì)胞或狀態(tài)不佳的細(xì)胞沖出瓶外。首次換液時(shí)間為取材24小時(shí)后，之后每隔3天換一次培養(yǎng)液，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合率達(dá)到70%至80%時(shí)，使用膠原蛋白酶消化

3、，1:2傳代至新的培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)使用傳代至第三代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，使用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)細(xì)胞向肝樣細(xì)胞定向分化。實(shí)驗(yàn)分為四大組：誘導(dǎo)組、NF-кB抑制組、P38MAPK抑制組以及陰性對(duì)照組。誘導(dǎo)組細(xì)胞的誘導(dǎo)環(huán)境為含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的完全培養(yǎng)液，抑制組分為NF-кB抑制組和P38抑制組，這兩組細(xì)胞是在HGF誘導(dǎo)組的基礎(chǔ)上分別添加了 NF-кB信號(hào)分子的抑制劑 BAY11-7082和P38MAPK信號(hào)分子的抑制劑 SB2035

4、80，其他培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)時(shí)間相同。陰性對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為含有10％胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基。取培養(yǎng)20天后的細(xì)胞進(jìn)行靛青綠（ICG）攝取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)已分化的肝細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)NF-кB、p-P38和α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）的表達(dá)，取培養(yǎng)第7天和第20天的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)NF-кB蛋白。
　　結(jié)果：誘導(dǎo)20天后，HGF誘導(dǎo)組中的大部分細(xì)胞呈圓形或卵圓形肝樣細(xì)胞狀生長(zhǎng)，靛氰綠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)

5、胞可攝取ICG，并在一定時(shí)間內(nèi)將ICG排出胞體外，免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示有特異的肝細(xì)胞標(biāo)志物α1-抗胰蛋白酶AAT的表達(dá)，免疫組化結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)7天時(shí)和20天時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)都有NF-кB的聚集，NF-кB在此過(guò)程中激活轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)；NF-кB抑制組和P38抑制組中細(xì)胞與對(duì)誘導(dǎo)組比，NF-кB抑制劑BAY11-7082和P38抑制劑SB203580的抑制效果明顯，細(xì)胞對(duì)ICG的攝取和表達(dá)的α1-抗胰蛋白酶蛋白表和誘導(dǎo)組相比來(lái)看都有比較明