骨髓間質(zhì)干細胞的磁性標記示蹤及丹酚酸B鹽協(xié)同間質(zhì)干細胞修復(fù)大鼠脊髓損傷的研究.pdf

1、干細胞包括胚胎千細胞(embryonic stem cells，ESCs)和成體T細胞，這類細胞可以在體外培養(yǎng)和快速增殖，同時具有向自我更新和多向分化潛能，是目前多種疾病實驗研究和臨床治療的熱點。干細胞移植后能夠分泌治療性物質(zhì)，并可能修復(fù)和替代損傷性疾病中受損的神經(jīng)組織。因此，干細胞移植為脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病帶來了希望。骨髓間質(zhì)千細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是成體干細胞的一種，獲取簡單，擴增

2、容易，可在體外和體內(nèi)向神經(jīng)元樣細胞分化，受到研究者更多的重視。 脊髓損傷(spinal cord injures，SCI)是臨床常見疾病，給患者帶來了極大痛苦，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。脊髓損傷的藥物治療受限于有限的藥物種類和狹窄的治療時間窗，康復(fù)治療的效果也不能令人滿意。目前，研究者更多將目光轉(zhuǎn)向干細胞移植治療脊髓損傷，MSCs自然受到研究者的青睞。本室對MSCs單獨或結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)因子及嗅鞘細胞治療脊髓損傷的療效和機制進行探討，

3、肯定了MSCs治療脊髓損傷的有效性。 然而，MSCs治療脊髓損傷的實驗研究和臨床應(yīng)用也遇到和其他細胞移植同樣的問題：首先是用來區(qū)分宿主細胞與移植細胞的傳統(tǒng)標記和識別方法只能在離體情況下進行，顯然，這些方法用于大動物實驗或者臨床研究時不可行。所以有必要尋找能夠在體示蹤檢測和追蹤移植細胞命運的方法。將需要移植的細胞進行磁性對比劑標記，通過磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術(shù)對其進行可視化追蹤

4、，就能得知移植細胞在體內(nèi)的運動信息以及未來命運。釓-二亞甲基三胺五乙酸-葉酸(Gadolinium diethylenetriaminepentaacetic acid，Gd-DTPA)是一種T1造影劑，和鐵劑類T2造影劑一樣可用于細胞標記。Gd-DTPA相比其他造影劑用于細胞標記的優(yōu)點在于其較少受到血流和周圍其他正常和非正常組織結(jié)構(gòu)信號的影響。那么，能否用Gd-DTPA標記MSCs來進行MSCs的在體MRI示蹤?這是本課題要探討的一個

5、重要內(nèi)容。另外一個問題是成年個體中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)，尤其是損傷的CNS很可能不利于移植細胞的存活。即使是在細胞最好的狀態(tài)下進行移植，據(jù)報道最多能有10﹪的移植細胞存活，而能夠分化成為成熟神經(jīng)元的移植細胞則更少。雖然在脊髓損傷的實驗研究中，很多研究者建議細胞移植時間窗應(yīng)選在損傷后7-10天，但有證據(jù)表明存活細胞數(shù)量仍不樂觀。大部分細胞治療用于打擊性或壓迫性脊髓損傷是采用髓內(nèi)注射的方式，而注

6、射器的刺入很可能對受損脊髓造成又一次大的損害。脊髓損傷后的微環(huán)境和隨后注射造成的損害中，腫瘤壞死因子-α(tIJmor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥因子及其引起的一系列炎癥反應(yīng)是一種重要因素。丹酚酸B鹽(Salvianolic acid B，SalB)是我國傳統(tǒng)中藥丹參(salvia miltiorrhiza，Danst]en)的水溶性有效成分，已有研究證明Sal B具有很強的抗氧化作用和明顯的抗炎作用。還有研

7、究表明，復(fù)方丹參注射液可以用于治療脊髓損傷。那么，應(yīng)用Sal B能否促進移植的MSCs的存活呢?這是本課題要研究的又一重要內(nèi)容。 綜上所述，本研究擬采用帶有紅色熒光的陽離子轉(zhuǎn)染試劑jetPEI-FluoR負載的Gd標記MSC(Gd-MSCs)，觀察Gd標記對MSCs存活和增殖能力的影響，電鏡檢測Gd在MSCs內(nèi)的分布情況，并對移植到大鼠脊髓損傷節(jié)段的Gd-MSCs進行MRI活體示蹤；觀察Sal B的神經(jīng)保護作用以及是否在體外保護

8、MSCs不受TNF-α的損傷，觀察Sal B是否能促進移植到受損脊髓的MSCs的存活及兩者聯(lián)合應(yīng)用后脊髓損傷大鼠的運動功能恢復(fù)情況。 本實驗的研究內(nèi)容由以下兩部分組成： 第1部分：骨髓間質(zhì)干細胞的磁性標記示蹤 目的：觀察Gd-DTPA成功標記MSCs后對其生物學(xué)特性的影響，觀察MSCs中Gd-DTPA的分布情況，MRI示蹤植入到脊髓損傷大鼠體內(nèi)的MSCs，探討Gd-DTPA標記MSCs的方法用于脊髓損傷研究的可行

9、性。 方法：接種培養(yǎng)大鼠MSCs，用陽離子轉(zhuǎn)染試劑jetPEI-FluoR結(jié)合Gd-DTPA標記MSCs。透射電鏡觀察Gd-DTPA在MSCs胞膜和胞漿的分布情況，MRI觀察標記后MSCs的信號強度變化。用臺盼藍染色、MTT比色法和Hochest 33342染色法檢測Gd-DTPA標記對MSCs的存活、增殖及凋亡的影響。移植標記的MSCs到脊髓損傷大鼠受損脊髓節(jié)段內(nèi)，然后用MRI觀察MSCs的分布和遷移情況，并用組織學(xué)方法驗證。

10、同時BBB評分評價標記的MSCs對脊髓損傷大鼠的功能恢復(fù)情況。 結(jié)果： 1．Gd-DTPA能夠成功標記MSCs，且標記效率不低于80﹪。Gd-DTPA標記的MSCs在1.5T核磁共振掃描圖像上清晰可見，標記的MSCs在T1加權(quán)圖像上的信號強度明顯增強。透射電鏡證實Gd-DTPA存在于MSCs內(nèi)。 2．Gd-DTPA標記不影響細胞存活、增殖和凋亡。 3．標記的MSCs在細胞移植后14天仍能夠檢測到信號強度的

11、明顯變化。標記細胞相對周圍脊髓組織的信號強度增高在第1，3，7，14天分別為26.61﹪，22.81﹪。19.88﹪，14.42﹪。但是，到了移植后第21天，信號強度增高只有8.77﹪。MRI上，標記MSCs從注射處向損傷區(qū)遷移，并且在移植后第14天和第21天，沒有發(fā)現(xiàn)細胞在損傷區(qū)以外區(qū)域出現(xiàn)，組織學(xué)結(jié)果也證實這一點。 4．標記MSCs和未標記MSCs移植的脊髓損傷大鼠的BBB評分從移植第7天開始比對照組的大鼠的評分高(P(0.

12、05)，而兩者之間則沒有顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：Gd-DTPA可有效標記MSCs；MRI可在體示蹤移植到大鼠脊髓損傷節(jié)段的Gd-DTPA-MSCs，標記細胞集中分布在損傷區(qū)域。Gd-DTPA-MSCs的MRI示蹤可能是闡明MSCs治療脊髓損傷和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病作用機制的重要示蹤方法。 第2部分：丹酚酸B鹽協(xié)同間質(zhì)干細胞修復(fù)大鼠脊髓損傷 目的：觀察Sal B對脊髓損傷的神經(jīng)保護作用，觀察Sal B是否

13、保護MSCs不受TNF-α的損害，以及是否能促進移植的MSCs在損傷脊髓的存活數(shù)量，探討聯(lián)合應(yīng)用Sal B和MSCs治療大鼠脊髓損傷的可行性。 方法：體外培養(yǎng)大鼠MSCs，觀察Sal B對MSCs在TNF-α存在條件下的存活的影響?？斩疵娣e分析和BBB評分觀察Sal B對大鼠脊髓損傷的神經(jīng)保護作用。大鼠脊髓損傷后第7天，移植5-溴脫氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)標記的MSCs，并腹腔注射Sal B。

14、采用BBB評分評價大鼠的運動功能恢復(fù)情況：細胞注射后7天和28天進行灌注取材，免疫組織化學(xué)染色觀察移植的MSCs的存活情況，觀察Sal B促進移植的MSCs存活的作用。 結(jié)果： 1．分別用TNF-α或TNF-α聯(lián)合丹SalB處理MSCs，觀察其對MSCs存活的影響。10ng/ml TNF-α作用24小時后MSCs大部分邊緣翹起，呈半漂浮狀；而100ng/mlSalB存在時，TNF-α對MSCs幾乎沒有影響。 2．

15、SalB可以顯著減小損傷大鼠脊髓的空洞面積(P<0.05)，從脊髓損傷后第14天起，SalB和PBS對照治療組之間的BBB評分有顯著差異(P<0.05)。 3．MSCs和SalB聯(lián)合應(yīng)用組的大鼠損傷部位有很多存活的MSCs聚集，而單純MSCs組的細胞存活則比較少。存活細胞計數(shù)分析結(jié)果表明在移植后的第7天和28天，聯(lián)合應(yīng)用組的MSCs存活數(shù)量都比單獨MSCs應(yīng)用組要多(P<0.5)。聯(lián)合應(yīng)用組大鼠的運動功能恢復(fù)要比單純MSCs恢復(fù)

16、的要好(P<0.5)。 結(jié)論：SalB可以減少脊髓損傷空洞形成。SalB在體外保護MSCs免受TNF-α的毒性作用，在體內(nèi)促進移植的MSCs的存活；聯(lián)合應(yīng)用MSCs和SalB能更好地促進脊髓損傷大鼠的功能恢復(fù)。 總結(jié) 通過以上實驗研究，可得到以下結(jié)果： 1．Gd—DTPA能有效標記MSCs并且不影響MSCs的牛物學(xué)特性； 2．Gd—DTPA標記的MSCs在移植后14天內(nèi)可用MRI活體示蹤；