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1、目的和意義:環(huán)境污染伴隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展而出現(xiàn)。研究表明,糖尿病發(fā)生除了觀察到胰島素分泌不足或胰島素拮抗直接導(dǎo)致的作用外,由遺傳、環(huán)境、行為等因素的共同作用也不容忽視。α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)為世人所認(rèn)識(shí)的是其與臨床2型糖尿病有關(guān),而這種酶的抑制劑則與2型糖尿病的治療相關(guān)。而口服抗糖尿病藥物,通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶的作用而影響碳水化合物的吸收,對(duì)糖尿病治療起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)的作用。開展對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究,不僅具有生物
2、與醫(yī)療方面的價(jià)值,也與環(huán)境污染的相關(guān)研究有著密切的聯(lián)系。
α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)水解α-葡萄糖苷酶非還原端末端1-4α-連接的D-葡萄糖的殘基,最后一步是消化碳水化合物,α-葡萄糖苷酶活性與血糖水平直接相關(guān)。由于它在二型糖尿病患者葡萄糖的吸收中具有潛在的下調(diào)作用,因而具有重要的臨床意義。有幾種類型的α-葡萄糖苷酶抑制劑被報(bào)道過(guò),包括基質(zhì)類似物,生物堿類,酚類物質(zhì),姜黃素類化合物和天然原料中的花青素。這些抑制
3、劑治療通常是用來(lái)口服的。它的通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶活性進(jìn)而阻止碳水化合物的消化吸收和糖類的生成。工業(yè)上,α-葡萄糖苷酶常用來(lái)將淀粉轉(zhuǎn)換成發(fā)酵糖,這是酒精生產(chǎn)的重要步驟.這種酶還可以水解各種各樣的吡喃葡萄糖苷,例如蔗糖,海藻糖和麥芽糖。然而,對(duì)這種酶折疊過(guò)程中的構(gòu)象和活性變化研究不多。因此,對(duì)該酶結(jié)構(gòu)和功能的研究具有重要意義。
三氟乙醇(簡(jiǎn)稱TFE)的變性實(shí)驗(yàn)有助于理解酶的催化作用,穩(wěn)定性,包括維持酶二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力、
4、構(gòu)象的柔性、緊密性和折疊途徑。因此TFE常被用做研究酶結(jié)構(gòu)特征的變性劑,而且TFE對(duì)酶活性和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響已經(jīng)得到了很好的證明。已經(jīng)做了對(duì)酶活性和結(jié)構(gòu)在有機(jī)溶劑中的變化的廣泛的研究。TFE在蛋白質(zhì)折疊研究中常被用來(lái)做潛溶劑,因?yàn)樗軌蛟跐舛容^低的時(shí)侯通過(guò)破壞疏水結(jié)構(gòu)從而使蛋白質(zhì)的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,TFE也常被用來(lái)鑒定與蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病。
Zn2+是很多酶的輔助因子,也充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子角色和突觸傳遞中的底物。Zn>是
5、有助于機(jī)體正常生長(zhǎng)和發(fā)育,增強(qiáng)免疫功能,促進(jìn)傷口愈合。因此Zn2+是機(jī)體的一個(gè)必要成分,在新陳代謝和疾病中起著重要的作用。由于Zn2+在細(xì)胞功能方面的重要性,維持身體健康要求飲食中含有足夠多的Zn2+。但是,有研究表明在特定條件下Zn2+會(huì)直接抑制酶的功能,α-葡萄糖苷酶和Zn2+的關(guān)系還不是很清楚,先前基于精漿內(nèi)含物的研究顯示α-葡萄糖苷酶和Zn2+可能在人類生殖方面起重要作用,但是α-葡萄糖苷酶和Zn2+的直接關(guān)系還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。
6、> 在TFE和Zn2+存在的情況下進(jìn)行了對(duì)α-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)分析更進(jìn)一步了解其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。通過(guò)用TFE和Zn2+結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)研究,來(lái)觀察任何誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)的改變。TFE和Zn2+誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶的失活研究為這種酶的抑制作用提供了新的認(rèn)知,同時(shí)暗示了TFE和Zn2+可能具有的臨床應(yīng)用。
研究方法:
1)測(cè)量不同濃度TFE對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性影響并
7、記錄數(shù)值。
2)保持底物濃度不變,改變TFE和α-葡萄糖苷酶的濃度,同樣測(cè)定其活性,并作圖對(duì)比判斷抑制類型。
3)改變TFE和底物的濃度,保持酶的濃度不變,測(cè)定數(shù)據(jù)作雙倒數(shù)圖,判斷抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
4)使用不同高濃度的TFE,固定底物濃度和酶濃度,按照作用時(shí)間不同測(cè)定活性,繪制酶活性的抑制變化時(shí)間過(guò)程圖。
5)通過(guò)內(nèi)源熒光和ANS結(jié)合熒光光譜學(xué)分析方法分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)特征。
8、 6)最后使用計(jì)算機(jī)模擬同源建模的方式,預(yù)測(cè)α-葡萄糖苷酶3D結(jié)構(gòu)及其與TFE的結(jié)合位點(diǎn)。
7)測(cè)定不同濃度Zn2+對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性影響,并記錄數(shù)值。
8)保持底物濃度不變的情況下,改變Zn2+和α-葡萄糖苷酶的濃度,同樣測(cè)定其活性,并作圖對(duì)比判斷抑制類型。
9)使用不同濃度的Zn2+,固定底物濃度和酶濃度,按照作用時(shí)間不同測(cè)定活性,繪制酶活性的抑制變化時(shí)間過(guò)程圖。
10
9、)改變Zn2+和底物的濃度,保持酶的濃度不變,測(cè)定數(shù)據(jù)作雙倒數(shù)圖,判斷抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
11)最后使用計(jì)算機(jī)模擬的方式,預(yù)測(cè)α-葡萄糖苷酶與Zn2+的結(jié)合位點(diǎn)。
結(jié)果:
1) TFE對(duì)α-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)和功能影響研究:TFE濃度低的時(shí)候(低于2%)α-葡萄糖苷酶活性有輕微的激活,之后隨著TFE濃度的增加其活性喪失呈現(xiàn)劑量依賴性。半抑制劑濃度IC50大約是7+0.2%(0.97+0.028M)。
10、TFE濃度低于2%時(shí)酶活性與天然酶活性相比增加20%。當(dāng)TFE濃度增加到12%時(shí),酶的活性完全喪失。使酶活性完全喪失需要相當(dāng)高的濃度,這很可能跟TFE的溫和親電子性有關(guān)。通過(guò)不同濃度的酶和不同濃度的TFE做剩余活性曲線判斷TFE對(duì)酶作用的可逆性。結(jié)果中可以看出,所有的直線都經(jīng)過(guò)原點(diǎn),表明TFE對(duì)酶的作用是可逆的。
通過(guò)時(shí)間間隔實(shí)驗(yàn)測(cè)量出速率常數(shù)并估算失活動(dòng)力學(xué)常數(shù)。TFE對(duì)葡萄糖苷酶活性的減少屬于時(shí)間依賴性的一級(jí)反應(yīng)。當(dāng)T
11、FE濃度低于2%時(shí),酶的活性不但不會(huì)喪失反而會(huì)激活了20%。當(dāng)TFE活性高于6%時(shí),活性以兩種途徑喪失:一部分在非常短的時(shí)間內(nèi)喪失(不超過(guò)30秒)以至于不能夠測(cè)量出來(lái),余下部分以一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)過(guò)程逐漸失活。
通過(guò)內(nèi)源熒光光譜測(cè)量TFE對(duì)α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)的影響。觀察到了TFE與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合直接誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶構(gòu)象變化:TFE濃度低于2%時(shí),熒光光譜沒(méi)有變化,但是當(dāng)濃度超過(guò)3%時(shí),熒光光譜發(fā)生了顯著的改變,TFE濃
12、度為50%時(shí),最大峰位置的紅移達(dá)到最高值,這表明TFE和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)。我們用ANS結(jié)合熒光來(lái)觀察TFE誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶疏水性表面的變化。結(jié)果顯示,隨著熒光強(qiáng)度的增加,TFE誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶的疏水表面逐漸暴露出來(lái)。綜上所述,內(nèi)源和ANS-熒光探針都直接反映出TFE誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶發(fā)生了去折疊現(xiàn)象。
利用HHsearch和T-Coffee方法從十個(gè)模板結(jié)構(gòu)中找出序列對(duì)比。用PQR-SA開發(fā)出了α-葡萄
13、糖苷酶的同源結(jié)構(gòu)。TFE對(duì)α-葡萄糖苷酶誘導(dǎo)失活的模擬對(duì)接顯示:ASP68,TYR71,VAL108,HIS111,PHE177,ASP214,THR215,GLU276,HIS348,ASP349和ARG439等氨基酸殘基與TEE發(fā)生了相互作用,分子動(dòng)力學(xué)模擬證實(shí)了TFE誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶失活時(shí)的結(jié)合機(jī)制和結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)10毫秒分子動(dòng)力學(xué)模擬,模擬結(jié)果顯示TFE貫穿到了酶的核心,停留在與葡萄糖基團(tuán)結(jié)合的氨基酸殘基上,這表明TFE可能是
14、一種抑制劑,能抑制α-葡萄糖苷酶的活性。
2) Zn2+對(duì)α-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)和功能影響研究:在Zn2+濃度為0.3 mM時(shí),酶的活性完全喪失,半抑制劑濃度IC50大約是0.056±0.006 mM,α-葡萄糖苷酶活性的喪失需要相當(dāng)高濃度Zn2+。Zn2+對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制的可逆性結(jié)果顯示所有直線都通過(guò)原點(diǎn),表明Zn2+抑制酶的活性反應(yīng)是是可逆的。二次作圖可以看出Zn2+對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制并不是簡(jiǎn)單的直線混合
15、型抑制而是拋物線混合型抑制。利用半對(duì)數(shù)圖標(biāo)繪的動(dòng)力學(xué)分析顯示單相和雙相失活包含快相和慢相兩個(gè)過(guò)程,隨著Zn2+濃度的增加單相發(fā)展成兩相進(jìn)程,所有進(jìn)程都是一級(jí)動(dòng)力學(xué)。
觀測(cè)到Zn2+結(jié)合α-葡萄糖苷酶直接誘導(dǎo)三級(jí)結(jié)構(gòu)改變。隨著劑量的加大,熒光光譜強(qiáng)度明顯減少,最大峰值發(fā)生明顯的紅移。當(dāng)Zn2+濃度為50 mM時(shí),離子濃度趨于飽和狀態(tài)紅移達(dá)到最大峰值。通過(guò)ANS結(jié)合熒光光譜的測(cè)量發(fā)現(xiàn)由于Zn2+的結(jié)合,使α-葡萄糖苷酶的疏水表
16、面得到輕微的暴露。
同時(shí)對(duì)Zn2+和α-葡萄糖苷酶進(jìn)行了10毫微秒的分子動(dòng)力學(xué)模擬。模擬顯示10個(gè)鋅離子可能和57個(gè)α-葡萄糖苷酶殘基發(fā)生相互作用。分子動(dòng)力學(xué)模擬也證明了Zn2+對(duì)α-葡萄糖苷酶的結(jié)合機(jī)制,顯示Zn2+結(jié)合位點(diǎn)并不是落在α-葡萄糖苷酶的葡糖糖結(jié)合口袋。
結(jié)論:
1) TFE和Zn2+可以導(dǎo)致α-葡萄糖苷酶的變性。
2) TFE和Zn2+誘導(dǎo)的α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)變化中
17、,活性位點(diǎn)的穩(wěn)定性比其他部分結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性更高。
3)低濃度TFE和Zn2+誘導(dǎo)了整體結(jié)構(gòu)的變化,但活性位點(diǎn)仍然保持完整。
4) TFE和Zn2+不直接與底物競(jìng)爭(zhēng),但會(huì)改變?chǔ)?葡萄糖苷酶三級(jí)結(jié)構(gòu)。
5) TFE和Zn2+與α-葡萄糖苷酶配體結(jié)合導(dǎo)致了酶活性的混合型抑制。
6)α-葡萄糖苷酶三級(jí)結(jié)構(gòu)改變的原因是疏水表面的暴露。
7)計(jì)算機(jī)模擬TFE和Zn2+與α-葡萄糖苷
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