脂肪間質干細胞結合β磷本三鈣局部移植及系統(tǒng)應用活性維生素D修復骨缺損的作用研究.pdf

1、研究背景:腫瘤、損傷及先天畸形導致的骨組織缺損一直是臨床醫(yī)生面臨的難題。多年來，學術界不斷探索針對骨組織缺損的修復方式，其中骨組織工程可謂是最有前景的治療手段之一。傳統(tǒng)的組織工程在修復骨缺損時，通常采用骨髓基質干細胞作為工程細胞與支架材料結合移植到骨缺損中。骨髓基質干細胞在成骨分化、分泌骨基質及誘導礦化方面的能力毋庸置疑，但是將骨髓基質干細胞廣泛應用于臨床治療尚存在一些不利因素，例如骨髓基質干細胞在體內的儲量非常有限，提取過程復雜且創(chuàng)傷

2、大。因此，近年來，學者們開始嘗試探索其他來源的同樣具有多能分化潛質的細胞來代替骨髓基質干細胞。這些細胞包括:脂肪間質干細胞(ADSC)、成肌細胞、軟骨細胞、成纖維細胞、臍帶血干細胞、皮膚前體細胞、間皮細胞以及卵巢濾泡顆粒細胞等。他們具有干細胞性質并可分化為三個胚層中任何一種細胞系。在這些細胞中，ADSC或許是最適合骨組織工程的細胞，因為它在體內脂肪組織中存量相當豐富，易于提取，收集過程創(chuàng)傷較小，且在體外生長迅速，對培養(yǎng)條件要求不高，經(jīng)過

3、簡單的成骨分化誘導就可以快速地表達成骨細胞特異性蛋白。ADSC程梭形，與支架材料親和性高，經(jīng)成骨分化誘導后，可表達成骨細胞相關特異性標記物如:堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)、及runt相關轉錄因子2(Runx2)等。除干細胞外，支架材料也是組織工程的重要組成要素，而骨組織工程應用最廣泛的支架材料當屬磷酸三鈣(TCP)。磷酸三鈣可分為兩個亞型即α-TCP和β-TCP。早期骨組織工程多選用α

4、-TCP作為支架材料，然而與α-TCP相比，近來備受關注的β-TCP具有更好的組織相容性，以及更接近于新骨形成速率的降解率，并且降解后無任何殘留。β-TCP與ADSC共培養(yǎng)時，ADSC可在24小時內覆蓋β-TCP表面95％的面積。另外，β-TCP還具有一定的誘導成骨細胞分化的作用。組織工程最后一個重要構成就是細胞因子，常用的細胞因子有骨形成蛋白2和7（BMP-2，BMP-7）等，BMP是一族生長因子家族，可調控骨及軟骨的形成，但BMP復

5、合支架材料價格相對昂貴，難以在臨床廣泛應用。多年來，1，25(OH)2D3即維生素D體內活性形式骨化三醇(calcitrol)及其類似物由于可以增加骨礦化密度(BMD)及相對低廉的價格，一直被用于治療骨質疏松癥，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，成骨細胞、骨細胞以及破骨細胞均有維生素D受體(VDR)的表達。我們推測，calcitrol及其類似物可以直接作用于上述骨組織細胞，調節(jié)其功能活性。因此，我們希望通過將ADSC，β-TCP以及calcitrol或

6、其類似物結合起來，探索一種用于修復骨組織缺損的新型組織工程治療方案，并揭示其作用機制。
　　實驗目的:本實驗的目的在于通過一系列體內及體外實驗，來評價ADSC，β-TCP以及calcitrol結合修復骨缺損的效果，并深入探究活性維生素D及其類似物影響成骨細胞及破骨細胞功能活性的機制，最后，對比calcitrol及其類似物之一艾地骨化醇(eldecalcitol)在治療骨缺損效果上的差異，希望得到一種最佳的治療方案組合。
　　

7、實驗方法:在第一階段研究中，我們提取大鼠皮下脂肪組織，分離獲得ADSC并于體外進行培養(yǎng)。當細胞生長至80％接觸后，將ADSC與預制備的β-TCP滅菌顆粒共同培養(yǎng)并將培養(yǎng)基更換為成骨分化誘導培養(yǎng)基。共培養(yǎng)21天后，制備大鼠股骨缺損模型，并使用附有ADSC的β-TCP顆粒進行修復。術后經(jīng)腹腔注射給予calcitrol（125ng/Kg，1次/2天），于治療第7天、14天及28天取股骨標本，進行組織形態(tài)學分析，評價骨修復效果。在實驗第二階段，

8、我們對體外培養(yǎng)的成骨細胞系MC3T3-E1細胞進行成骨分化誘導，并向培養(yǎng)基中分別加入calcitrol(10-8M)及eldecalcitol（10-8M），刺激7天及14天后提取總蛋白，通過westernblot檢測調控成骨細胞功能的Runx2，以及調控破骨細胞分化的核因子kB配體受體激活劑(RANKL)及骨保護素(OPG)等蛋白，以期揭示活性維生素D及其類似物調控骨形成及骨吸收的機制。在第三階段實驗中，我們同樣制備大鼠股骨缺損模型，

9、在不進行支架材料植入的情況下，經(jīng)口投給calcitrol（50ng/kg，1次/2天）及eldecalcitol（50ng/kg，1次/2天）治療，分別于28天及56天時，通過組織形態(tài)學手段，對比calcitrol及eldecalcitol在骨缺損修復中的效果。
　　實驗結果:第一階段實驗發(fā)現(xiàn)，ADSC，β-TCP及calcitrol聯(lián)合用于骨缺損修復時，可以明顯增加新骨形成的量，同時，由于ADSC的存在，在新骨形成區(qū)域，檢測到高

10、水平表達的ALP和Runx2。Calcitrol在骨缺損修復早期，表現(xiàn)出對破骨細胞強烈的抑制作用，在減少破骨細胞數(shù)量的同時，也抑制了組織蛋白酶K(CK)的表達。第二階段實驗證實，在體外培養(yǎng)體系中加入calcitrol及eldecalcitol均可促進MC3T3-E1細胞Runx2及OPG的表達，并抑制RANKL的表達。而calcitrol對MC3T3-E1的這種調控作用略強于eldecalcitol。第三階段實驗發(fā)現(xiàn)，在分別應用calc

11、itrol（CAL組）和eldecalcitol（ELD組）治療骨缺損28天后，CAL組新骨形成量略高于ELD組，且兩實驗組均明顯高于對照組。治療56天后，CAL組和ELD組在新骨骨量上已沒有明顯差異，但ELD組新骨基質中未礦化膠原面積略大于CAL組。CK染色顯示，28天時，calcitrol即表現(xiàn)出對CK陽性破骨細胞較強的抑制作用，而在ELD組，這種對破骨細胞的抑制作用在56天時才開始顯現(xiàn)。
　　結論:1.ADSC經(jīng)成骨分化誘導

12、，并以β-TCP為載體植入骨缺損后，可以大量表達ALP，并在缺損修復早期表達高水平的Runx2。2.活性維生素D體內投給可明顯減少破骨細胞的數(shù)量，并且抑制CK的表達。3.Calcitrol及eldecalcitol可直接作用于成骨細胞，促進Runx2及OPG的表達，促進成骨，并可抑制成骨細胞表達RANKL，從而間接抑制破骨細胞分化。4.與eldecalcitol相比，calcitrol可以更快的促進骨缺損區(qū)新骨的形成及礦化，且對破骨細胞