PD-1負(fù)性和OX40正性共刺激信號(hào)在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫病理中的作用機(jī)制及臨床意義.pdf

1、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是累及關(guān)節(jié)的炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為對(duì)稱(chēng)性的關(guān)節(jié)疼痛和腫脹，伴發(fā)軟骨和骨質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形造成殘疾，部分RA患者還同時(shí)合并肺部、眼部、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，是造成人類(lèi)喪失勞動(dòng)力和致殘的重要原因之一。RA的病理特點(diǎn)包括關(guān)節(jié)滑膜的增生，新生血管的形成以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　RA的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境和免疫因素。其免疫病理機(jī)制主要表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞介

2、導(dǎo)的自身免疫性疾病，在RA的自身免疫進(jìn)程中，炎性T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等浸潤(rùn)關(guān)節(jié)滑膜，細(xì)胞之間的相互作用導(dǎo)致自身抗體的生成和促炎癥細(xì)胞因子的分泌。集落刺激因子、趨化因子和粘附分子的表達(dá)招募巨噬細(xì)胞樣的滑膜細(xì)胞和破骨細(xì)胞，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)遭到破壞。其中CD4+輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th)在RA免疫病理中的作用至關(guān)重要，包括Th1、Th2、Th17細(xì)胞等。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，在RA中存在異常升高的CD4+CD28-

3、T細(xì)胞亞群，以非CD28依賴(lài)的方式持續(xù)活化，具有長(zhǎng)期存活、克隆擴(kuò)增的特性，被視作是自身反應(yīng)性的效應(yīng)性記憶性T細(xì)胞。
　　T細(xì)胞的活化需要雙信號(hào)，抗原肽-MHC分子復(fù)合物與T細(xì)胞表面受體(TCR)結(jié)合提供第一信號(hào)，第二信號(hào)則來(lái)源于抗原提呈細(xì)胞(APCs)和 T細(xì)胞表面共刺激分子間的相互作用。共刺激分子包括B7/CD28和腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體(TNF/TNFR)超家族，在調(diào)控T細(xì)胞的活化中發(fā)揮重要的作用。
　　PD-1

4、屬于B7/CD28家族共刺激分子，PD-L1是其配體之一，與PD-1結(jié)合后抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌。人PD-1Δex3 mRNA剪接異構(gòu)體可能編碼可溶性PD-1(sPD-1)，具有阻斷PD-1/PD-L1負(fù)性信號(hào)和促進(jìn)T細(xì)胞增殖的功能。OX40與其配體OX40L屬于TNF/TNFR家族共刺激分子，OX40/OX40L信號(hào)在促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的生成、分化和活化中起著重要的作用。
　　PD-1和OX40信號(hào)的異常導(dǎo)致T細(xì)胞生物學(xué)

5、行為的改變。在動(dòng)物模型的研究中，PD-1信號(hào)缺失或被阻斷可以導(dǎo)致一系列自身免疫性疾?。欢鳲X40信號(hào)敲除或被阻斷則對(duì)自身免疫性疾病有治療作用。在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜液(synovial fluid,SF)中富含CD4+PD-1+和CD4+OX40+T淋巴細(xì)胞，提示PD-1和OX40信號(hào)異常參與了RA的免疫病理過(guò)程。
　　但是在RA患者中，PD-1的表達(dá)和CD28的缺失并不能清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞，以維持共刺激信號(hào)在自身免疫中

6、的平衡。由此推斷，在RA免疫病理中可能存在負(fù)性PD-1和正性O(shè)X40共刺激信號(hào)的失衡，促進(jìn)CD4+自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異?；罨瑥亩T發(fā)自身免疫而導(dǎo)致病情遷延不愈。
　　鑒此，本研究從RA患者臨床樣本和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠模型兩方面入手，分析PD-1和OX40在外周和炎性部位的表達(dá)，揭示兩者之間的相互關(guān)系。同時(shí)檢測(cè)RA患者和CIA小鼠中CD4+CD28-T細(xì)胞表面PD-

7、1和OX40的表達(dá)，通過(guò)分析CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細(xì)胞亞群的異常變化，探討PD-1和OX40信號(hào)的失衡在關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中的臨床病理意義。通過(guò)體外刺激，PD-1融合蛋白干預(yù)實(shí)驗(yàn)，揭示可溶性PD-1(sPD-1)在RA中的免疫病理作用。由此為RA診斷和預(yù)后判斷提供有臨床應(yīng)用意義的生物學(xué)標(biāo)志，同時(shí)也為提出新的免疫干預(yù)靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分PD-1和OX40在類(lèi)風(fēng)濕性和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎CD4+T細(xì)胞上的表

8、達(dá)
　　【目的】檢測(cè)RA患者和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠中PD-1和OX40的表達(dá)，分析兩者之間的關(guān)系，探討其在RA患者和CIA小鼠中的臨床意義。
　　【方法】選取71例RA患者作為研究對(duì)象，44例骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)患者作為疾病對(duì)照，47名健康志愿者作為健康對(duì)照(healthy controls,HC)。研究樣本的外周血(PB)標(biāo)本使用紅細(xì)胞裂解液處理，關(guān)節(jié)滑膜液(SF)使用透明質(zhì)酸酶消化和

9、密度梯度離心法處理，獲得單個(gè)核細(xì)胞。使用Ⅱ型膠原(CⅡ)誘導(dǎo)CIA小鼠模型，密度梯度離心法分離小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)RA患者和小鼠中CD4+T細(xì)胞表面PD-1和OX40的表達(dá)。同時(shí)通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中PD-1和PD-L1的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　(1)在RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中，CD4+T細(xì)胞比例與對(duì)照比較顯著下降(p=0.045)；CD28的表達(dá)較OA患者和HC

10、降低(p=0.019)；比較CIA和正常對(duì)照(NC)小鼠脾臟細(xì)胞中免疫分子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與RA患者中的表現(xiàn)一致。
　　(2)免疫熒光標(biāo)記、流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在RA患者外周血和關(guān)節(jié)滑膜液中PD-1和OX40在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)顯著升高(p<0.05)；同時(shí)在CD4+PD-1+T細(xì)胞中OX40的表達(dá)也明顯升高(p<0.01)。
　　(3)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，RA患者滑膜組織中PD-1(p=0.026)和PD-L1(p=0

11、.048)的表達(dá)較對(duì)照明顯升高。
　　(4)在CIA小鼠脾臟中，CD4+T細(xì)胞上PD-1(p<0.001)和OX40(p<0.001)的表達(dá)異常升高。
　　(5)臨床病理特點(diǎn)分析顯示，CD4+T細(xì)胞上PD-1和OX40的表達(dá)與RA患者的疾病活動(dòng)度、自身抗體的生成以及與CIA小鼠關(guān)節(jié)炎輕重和分期相關(guān)。
　　【結(jié)論】RA患者外周血和炎性微環(huán)境中CD4+PD-1+T細(xì)胞中OX40的表達(dá)異常升高，提示CD4+PD-1+T細(xì)胞獲

12、得了OX40正性共刺激信號(hào)，可能導(dǎo)致其異?；罨D4+T細(xì)胞上PD-1和OX40的表達(dá)與RA患者和CIA小鼠臨床病理特點(diǎn)相關(guān)，提示PD-1和OX40共刺激信號(hào)異?？赡茉谧陨黻P(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用。
　　第二部分 CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細(xì)胞亞群在類(lèi)風(fēng)濕性和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展中的臨床病理意義
　　【目的】通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)RA患者和CIA小鼠中CD4+T細(xì)胞表面CD28、PD-1和OX4

13、0的表達(dá)，揭示CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細(xì)胞亞群在自身免疫性關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展中的臨床病理意義。
　　【方法】收集71例RA患者外周血樣本，選擇44例OA患者和47例健康志愿者(HC)作為對(duì)照。Ⅱ型膠原(CⅡ)誘導(dǎo)CIA小鼠模型，采用地塞米松(dexamethasone,Dex)腹腔注射進(jìn)行干預(yù)。研究樣本的外周血標(biāo)本使用紅細(xì)胞裂解液處理，小鼠脾臟通過(guò)密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞。采用免疫熒光染色、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)RA

14、患者外周血和CIA小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞表面CD28、PD-1和OX40的表達(dá)，分析CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細(xì)胞亞群在RA患者和CIA小鼠中的變化。
　　【結(jié)果】
　　(1)RA患者和CIA小鼠中CD4+CD28-、CD4+CD28-PD-1low和CD4+CD28-OX40+T細(xì)胞亞群比例與對(duì)照比較明顯升高(p<0.05)。在RA患者外周血CD4+CD28-PD-1low T細(xì)胞亞群中OX40+細(xì)胞數(shù)

15、量與OA患者和HC比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.035)。
　　(2)與CD4+CD28-PD-1-T細(xì)胞亞群比較，CD4+CD28-PD-1low T細(xì)胞亞群具有CD45RAlowCD45ROhigh的免疫表型(p<0.01)。
　　(3)臨床病理特點(diǎn)相關(guān)性分析顯示，CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細(xì)胞亞群與RA患者和CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分、疾病活動(dòng)度以及自身抗體的生成密切相關(guān)。在不同臨床分期和是否并發(fā)關(guān)節(jié)外

16、表現(xiàn)的患病個(gè)體中也存在差異性變化。免疫抑制劑的治療顯著降低CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細(xì)胞亞群的數(shù)量，而隨著疾病的復(fù)發(fā)也顯示出異常變化。
　　【結(jié)論】在RA患者和CIA小鼠中存在異常變化的CD4+CD28-PD-1lowOX40+T細(xì)胞亞群，具有記憶性T細(xì)胞的免疫表型，同時(shí)與患病個(gè)體的臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。PD-1和OX40共刺激信號(hào)的失衡可能導(dǎo)致CD4+CD28-自身反應(yīng)性T細(xì)胞的長(zhǎng)期存活和異?；罨?，從而參與了自

17、身免疫性關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)展。
　　第三部分可溶性PD-1在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的免疫病理作用及臨床意義
　　【目的】檢測(cè)RA患者血清中可溶性PD-1(sPD-1)的含量，揭示sPD-1在RA患者中的異常表達(dá)及臨床意義。通過(guò)體外刺激及PD-1融合蛋白干預(yù)，闡明sPD-1在RA中的免疫病理作用。
　　【方法】收集83例RA患者血清，選取67例OA患者和88例健康志愿者(HC)血清作為對(duì)照，通過(guò)ELISA測(cè)定研究樣本血清中sPD-

18、1的含量。密度梯度離心法分離研究樣本外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，通過(guò)Real time RT-PCR檢測(cè)PBMCs中全長(zhǎng)PD-1(flPD-1)和缺失外顯子3的PD-1(PD-1Δex3) mRNA的表達(dá)。使用細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17體外刺激PBMCs，Real time RT-PCR檢測(cè)flPD-1和PD-1Δex3 mRNA的表達(dá)。分離純化RA患者CD4+T細(xì)胞，體外刺激，流式細(xì)胞測(cè)定CD4+T細(xì)胞表面PD-1

19、的表達(dá)；在PD-L1融合蛋白(PD-L1.Fc)包被或PD-L1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞共培養(yǎng)的T細(xì)胞中，加入PD-1融合蛋白(PD-1.Fc)；同時(shí)，在PD-L1.Fc包被的T細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入來(lái)自RA、OA患者和HC的熱滅活血清或關(guān)節(jié)滑液。CCK-8試劑盒測(cè)定T細(xì)胞的增殖。
　　【結(jié)果】
　　(1)RA患者血清中sPD-1的含量顯著升高，與對(duì)照相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.038)；RA患者外周血PBMCs中PD-1Δex3 mRN

20、A的表達(dá)與對(duì)照比較也異常升高(p=0.028)；sPD-1的含量與RA患者的疾病活動(dòng)度、類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)含量和免疫抑制劑治療顯著相關(guān)。
　　(2)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-17刺激在體外對(duì)PBMC中flPD-1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯調(diào)控作用(p>0.05)，但PD-1Δex3 mRNA的表達(dá)在體外受到細(xì)胞因子的刺激而顯著上調(diào)(p<0.05)。
　　(3)CD3體外刺激后，RA患者CD4+T細(xì)胞表面PD-1平均熒

21、光強(qiáng)度(MFI)顯著低于HC(p<0.05)；PD-L1.Fc對(duì)RA患者CD4+T細(xì)胞的抑制作用顯著低于HC(p<0.05)；PD-1.Fc能夠阻斷膜性PD-1和PD-L1的結(jié)合，明顯減弱PD-L1.Fc對(duì)T細(xì)胞的抑制作用(p<0.05)。
　　(4)添加RA患者的熱滅活血清或者關(guān)節(jié)滑膜液后，CD4+T細(xì)胞的增殖效應(yīng)明顯增強(qiáng)(p<0.001)；RA患者的血清或者關(guān)節(jié)滑液能夠明顯抵消或者逆轉(zhuǎn)PD-L1.Fc對(duì)T細(xì)胞的抑制作用(p<0

22、.05)，而在對(duì)照血清和滑液中的CD4+T細(xì)胞，PD-L1.Fc所介導(dǎo)的抑制作用仍然存在。
　　【結(jié)論】在RA患者的血清中存在過(guò)度表達(dá)的sPD-1，且與患者的臨床特點(diǎn)密切相關(guān)，提示可被視作RA診療新的臨床免疫指標(biāo)。sPD-1和RA患者的炎性介質(zhì)在體外明顯減弱或逆轉(zhuǎn)PD-L1.Fc所介導(dǎo)的T細(xì)胞抑制效應(yīng)，證實(shí)在RA中sPD-1阻斷了PD-1/PD-L1負(fù)性信號(hào)導(dǎo)致T細(xì)胞活化。
　　綜上所述，本研究獲得以下研究結(jié)果：