柴胡皂甙d誘導K562細胞凋亡的基因表達譜研究.pdf

1、白血病是嚴重危害人類生命健康的惡性疾病，也是我國十大高發(fā)惡性腫瘤之一。迄今白血病的治療仍主要采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療，但此療法副作用大，復發(fā)率高，且對機體正常免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。中藥以其調節(jié)陰陽平衡、注重整體、攻補兼施、毒副作用小、應用范圍廣等優(yōu)勢得到了醫(yī)學界的廣泛認可和重視，中藥及其有效成分的抗腫瘤機理研究已成為當今醫(yī)學研究的熱點，也將為人類腫瘤的治療開辟新的途徑。 柴胡皂甙d(Saikosaponins-d，SSd)

2、是從傳統(tǒng)中藥柴胡中分離、提取出來的一種具有糖皮質激素樣甾類環(huán)結構的皂甙衍生物。研究表明，柴胡皂甙d具有抗炎、抗驚厥、誘導細胞分化、調節(jié)免疫、抑制細胞增殖以及誘導細胞凋亡等多效生物效應。目前，國內外學者把柴胡皂苷d應用于腎病、肝纖維化、腫瘤等疾病的治療，并取得可喜成就，尤以柴胡皂甙d抗腫瘤作用的研究倍受矚目。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)柴胡皂甙d的抗腫瘤作用機理主要涉及調節(jié)機體免疫、抑制腫瘤細胞分裂與生長、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤細胞轉移、調節(jié)腫瘤

3、細胞信號傳導以及細胞毒作用等，其抗腫瘤作用是通過多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)來實現(xiàn)的。 為進一步闡明柴胡皂甙d的抗腫瘤作用機制，探討其對白血病細胞生長及轉錄水平的影響，我們采用寡核苷酸芯片技術從全基因組水平上研究了K562細胞基因的表達譜變化，從而在基因水平上對柴胡皂甙d抗腫瘤的具體作用機制進行研究，為后續(xù)的藥物臨床研究與開發(fā)提供實驗依據。 本研究分為以下兩部分： 第一部分：柴胡皂甙d對K562細胞增殖和凋亡的實驗研究

4、。 將細胞隨機分為5組，對照組為含0.1％DMSO的培養(yǎng)基，其余4組分別為含不同濃度SSd的培養(yǎng)基，五組細胞分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h和72h后，CCK-8比色法測定其對細胞生長的影響，流式細胞術(AnnexinV-FITC-PI)、細胞形態(tài)學(Hoechst33258染色)以及梯狀DNA電泳等方法檢測細胞凋亡。研究結果發(fā)現(xiàn)： 1、SSd處理前后不同時間之間OD值有顯著差異(F=121.567，P<0.001)

5、。除8μg/ml濃度組不同時間點之間的OD值無顯著差異(F=1.796，P=0.169)外，其余各濃度組OD值均有顯著差異(P<0.001)，雅分別為35.454、46.282、42.201和18.014，且OD值隨時間呈顯著上升趨勢。隨藥物作用時間的延長，8μg/ml濃度組的OD值有先升高后下降的變化趨勢，以0h時較低，24h時最高，72h最低。 2、對照組OD值顯著高于其它各藥物濃度組(F=65.547，P<0.001)。從

6、各時間點看，不同濃度組之間OD值的比較均有顯著差異(P<0.032)，以8μg/ml濃度組OD值最低，對照組最高。 3、不同藥物濃度與不同時間點之間存在交互效應(F=12.275，P<0.001)，表明隨著時間的變化，各組的OD值變化幅度不同，最大值在對照組72h，最小值在8μg/ml濃度組72h。 4、時間因素不同水平間的多重比較均有顯著性差異，均P<0.050。除1μg/ml和2μg/ml濃度水平間無顯著差異外(P=

7、0.854)，其余濃度因素不同水平間的兩兩比較都有顯著性差異(P<0.050)。 5、8μg/mlSSd作用K562細胞48h后，部分細胞染色質濃縮聚集，細胞核在光鏡下呈濃染致密的顆粒塊狀熒光，呈現(xiàn)明顯的細胞凋亡形態(tài)。DNA凝膠電泳出現(xiàn)典型的凋亡“梯狀”條帶。隨著SSd濃度的增高(1-8μg/ml)，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率也逐漸上升，分別為13.01％、18.29％、35.58％和43.41％，而對照組凋亡率為0.33％。

8、 以上結果表明SSd能有效抑制K562細胞的生長并誘導其凋亡，抑制效應呈明顯的時間.劑量依賴關系。 第二部分：應用AgilentHuman1A寡核苷酸芯片系統(tǒng)研究SSd誘導K562細胞凋亡的基因表達譜變化。 8μg/mlSSd作用48h后，分別提取對照組和處理組K562細胞的總RNA，利用AgilentRNA熒光線性擴增試劑盒合成熒光標記的cRNA，SSd處理組用Cy5標記，對照組用Cy3進行標記。標記好的cRNA

9、樣品經純化后與寡核苷酸芯片雜交，Agilent2565BA基因芯片掃描儀進行掃描，AgilentFeatureExtraction軟件進行數據分析及標準化處理。根據軟件給出的LogRatioPValue確定表達差異的基因，結合PANTt-IER數據分析系統(tǒng)將這些基因按照生物學功能進行歸類，并通過查閱GenBanK數據庫及相關文獻對部分差異顯著基因進行深入的分析和討論。 實驗結果表明在檢測的18716個基因和EST中，共篩出差異表

10、達基因359個，其中138個基因表達上調，221個基因表達下調。這些差異表達基因主要包括以下幾類：①與mRNA轉錄調控相關；②與細胞黏附有關；③與G蛋白介導的信號傳導相關；④與氧化磷酸化相關；⑤與細胞增殖和分化相關：⑥與細胞凋亡相關；⑦與免疫防御機制相關；⑧與細胞周期相關等。通過對細胞增殖分化相關基因PEG10、EMP2；凋亡相關基因CASP3、CASP8；mRNA轉錄調控相關基因CLOCK以及原癌基因TACC3等差異表達基因的功能及其

11、在代謝通路中的具體作用進行了詳細的分析后，我們認為SSd誘導細胞凋亡效應主要是通過調節(jié)細胞增殖與分化基因和凋亡相關基因的表達，從而抑制K562細胞增殖、促進細胞凋亡。而晝夜節(jié)律基因的高表達及癌基因的表達下調說明SSd能提高機體抵御腫瘤、防止腫瘤進一步惡化發(fā)展的能力，同時還可能提高腫瘤細胞對SSd作用的敏感性。 本研究首先采用CCK-8細胞活力檢測、Hoechst33258細胞核染色、流式細胞術(AnnexinV-PI)以及DNA