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文檔簡介
1、研究目的:
乙型重型肝炎病死率高,預(yù)后差。尋找可用于早期預(yù)示和早期診斷重型肝炎發(fā)生的分子標(biāo)志物是目前病毒性肝炎研究的熱點之一。越來越多的證據(jù)表明循環(huán)microRNAs(cir-miRNAs)可能作為潛在的疾病診斷生物標(biāo)志物。本課題旨在研究乙型肝炎重癥化過程中血清miRNA表達(dá)譜的變化以篩選差異表達(dá)的microRNA-210(miRNA-210)、評價血清miR-210水平與乙型肝炎重癥化進(jìn)程的關(guān)聯(lián)關(guān)系、探討miR-210在乙型
2、肝炎重癥化過程中的潛在功能及其作用機制,為乙型肝炎重癥化的早期預(yù)測、預(yù)防和治療提供新型靶標(biāo)。
研究方法:
1 miRNA芯片實驗
(1) miRNA表達(dá)譜分析:
用TaqMan(R) Human MicroRNA Array A分析健康人混合血清樣本(10例等體積混合)、慢乙肝輕度病人混合血清樣本(10例等體積混合)、乙型慢加急肝衰竭病人混合血清樣本(10例等體積混合)的miRNAs表達(dá)譜。
3、> (2)篩選差異表達(dá)miRNAs:
以(Ct<35)且(|△△Ct|≥2)為判定標(biāo)準(zhǔn),初步篩選可擴增檢測到的差異表達(dá)的miRNAs。
(3)候選miR-210的選擇:
以(Ct<35)且(△△Ct≤-2)為判定標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)一步篩選隨著乙型肝炎病情嚴(yán)重程度表達(dá)水平升高的miR-210用于單樣本RT-qPCR驗證。
2人群調(diào)查
(1)血清樣本:
30例慢乙肝輕度病人血清、30例慢乙
4、肝重度病人血清、30例乙型慢加急肝衰竭病人血清及30例健康對照血清。
(2) miR-210的再驗證:
針對miRNA芯片篩選出來的差異表達(dá)的miR-210進(jìn)行單樣本RT-qPCR驗證。
(3)其他檢測指標(biāo):
肝功能(ALT、AST、TBIL、PTA),血清HBV標(biāo)記物,病毒載量。
3動物實驗
經(jīng)小鼠尾靜脈注射Con A(20 mg/kg)制備小鼠急性肝衰竭模型,并于注射后6、
5、12、24小時處死動物,收集外周血和肝組織,檢測下列指標(biāo):
(1)缺氧探針染色:檢測缺氧肝細(xì)胞。
(2)熒光定量PCR:檢測肝組織和血清miR-210水平。
(3)熒光定量PCR:檢測小鼠肝組織miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10 mRNA水平。
4.體外實驗
HepG2.2.15細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空白對照(DEPC水)、模擬物陰性對照和miR-210模
6、擬物后,缺氧培養(yǎng)24 h或48 h后檢測下列指標(biāo):
(1) CCK8 assay:檢測HepG2.2.15細(xì)胞線粒體脫氫酶活性。
(2)病毒學(xué)指標(biāo)檢測:培養(yǎng)基上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA拷貝數(shù);HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBsAg mRNA水平。
研究結(jié)果:
1 miRNA芯片實驗結(jié)果
(1)血清中可檢測到miRNA的數(shù)量和表達(dá)水平隨著病情進(jìn)展顯著增加。
(2)乙
7、型肝炎病人血清let-7b等20個miRNAs表達(dá)水平顯著高于健康對照組。
(3)血清中miR-210、miR-324-5p、miR-423-5p表達(dá)水平隨著病情進(jìn)展顯著升高。
2人群調(diào)查結(jié)果
(1)輕/重度乙型肝炎和乙型慢加急肝衰竭病人血清中miR-210的水平顯著高于健康對照組(P<0.05),血清中miR-210表達(dá)水平隨著乙型肝炎病情進(jìn)展顯著性升高。
(2)慢性乙型肝炎患者血清miR-21
8、0水平與ALT/AST水平及血清總膽紅素水平呈正相關(guān)(P<0.05),與凝血酶原活動度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。
3動物實驗結(jié)果
(1)小鼠肝衰竭進(jìn)程存在動態(tài)缺氧現(xiàn)象。ConA暴露6h組和12h組小鼠肝細(xì)胞缺氧率顯著性增加(P<0.05),Con A暴露24 h組小鼠肝細(xì)胞缺氧率顯著高于0h組(P<0.05),但低于6h和12h組(P<0.05)。
(2)小鼠肝組織和血清miR-210表達(dá)水平隨著病情進(jìn)展顯
9、著升高。
(3)小鼠肝衰竭進(jìn)程miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10mRNA表達(dá)水平顯著性減少(P<0.05)。
4細(xì)胞實驗結(jié)果
(1)缺氧條件下miR-210過表達(dá)抑制HepG2.2.15細(xì)胞線粒體脫氫酶活性。
(2)缺氧條件下miR-210過表達(dá)抑制HBV DNA復(fù)制和HBsAg表達(dá)。
研究結(jié)論:
1.miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示:乙型
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