NCAM三種亞型高表達(dá)細(xì)胞模型的建立與低劑量鉛對其表達(dá)的影響.pdf

1、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)作為膜表面糖蛋白的一類，屬于細(xì)胞粘附分子免疫球蛋白超家族，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附作用，主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，在正常神經(jīng)元軸突的生長、突觸的可塑性、神經(jīng)纖維的成束及學(xué)習(xí)和記憶等過程中起重要作用，影響神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性。以往研究已經(jīng)證實，NCAM參與的神經(jīng)活動的多個過程與鉛神經(jīng)毒性機制涉及的幾個方面有關(guān)，這提示干擾NCAM的正常表達(dá)可能是鉛的神經(jīng)毒機制之一。NCAM在人腦內(nèi)，主要以NCAM-180、

2、NCAM-140、NCAM-120三種亞型(其分子量分別為180、140、120KD)表達(dá)。NCAM-180、NCAM-140屬跨膜糖蛋白，兩者通過跨膜區(qū)與胞內(nèi)細(xì)胞骨架連接便于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，NCAM-180的胞質(zhì)區(qū)比NCAM-140的含氨基酸殘基多，NCAM-120無胞質(zhì)區(qū)及跨膜區(qū)，通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)直接與膜相連，易于在膜表面運動，且只錨定于膜上的脂筏區(qū)域。NCAM三種亞型在神經(jīng)生長發(fā)育中的表達(dá)、功能和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的過程有所不同，

3、這可能與它們存在的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)，但其結(jié)構(gòu)與功能的具體關(guān)系目前研究還不多，還有待進一步研究。本研究擬通過基因工程技術(shù)建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120三種亞型各自的高表達(dá)細(xì)胞模型，并初步探索低劑量鉛對三種NCAM亞型表達(dá)的影響，為進一步探索鉛的神經(jīng)發(fā)育毒性機制與NCAM的神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)機制的關(guān)系打下基礎(chǔ)。
　　 研究目的：
　　 1.建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120三種亞型各自的

4、高表達(dá)細(xì)胞模型。
　　 2初步探索低劑量鉛作用對NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120表達(dá)的影響。
　　 研究內(nèi)容與方法：
　　 1.建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表達(dá)細(xì)胞模型轉(zhuǎn)染方法的探索：對lipofactaneTM2000、磷酸鈣和FuGENE(R)HD Transfaction Reagen三種試劑的轉(zhuǎn)染效果進行比較，并優(yōu)化有關(guān)轉(zhuǎn)染條件。分別用此三種方法對HEK-

5、293細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒(PMIG-GFP)，其中l(wèi)ipofactaneTM2000設(shè)DNA(μg)：lipofactaneTM2000(μl)為1∶1.25、1∶2.5、1∶3.75三種比例，F(xiàn)uGENE(R)HD TransfactionReagen設(shè)質(zhì)DNA(μg)：FuGENE(R) HD Transfaction Reagen(μl)為2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8六種比例進行轉(zhuǎn)染，顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后

6、48小時細(xì)胞熒光蛋白的表達(dá)情況以比較此三種方法的轉(zhuǎn)染效果。
　　 2.NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表達(dá)細(xì)胞模型的建立：擬建立SH-SY5Y細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的NCAM亞型高表達(dá)模型，對SH-SY5Y細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染T4-NCAM180、T4-NCAM140、T4-NCAM120質(zhì)粒，并使用免疫熒光和Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的情況，以判斷高表達(dá)細(xì)胞模型的建立的結(jié)

7、果。
　　 3.低劑量鉛作用對NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120表達(dá)的影響：以低濃度PbCl2對成功建立的高表達(dá)細(xì)胞模型進行染毒，用Western blot方法檢測NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120蛋白表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表達(dá)細(xì)胞模型轉(zhuǎn)染方法的探索
　　 1.1在FuGENE(R) HD Tr

8、ansfaction Reagen轉(zhuǎn)染中，當(dāng)DNA(μg)：FuGENE(R) HDTransfaction Reagen(μl)為2∶6和2∶7時的轉(zhuǎn)染率較高，均可達(dá)80％以上。
　　 1.2在lipofactaneTM2000轉(zhuǎn)染中，DNA(μg)：lipofactaneTM2000(μl)為1∶2.5和1∶3.75時的轉(zhuǎn)染率較高，均可達(dá)50％～60％，比例為1∶3.75時轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒作用較大，轉(zhuǎn)染過程中產(chǎn)生的死細(xì)胞較

9、多。
　　 1.3三種試劑對HEK-293細(xì)胞進行PMIG-GFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染中以FuGENE(R)HDTransfaction Reagen2∶6和2∶7的比例時的轉(zhuǎn)染效率較高，且細(xì)胞毒性較少，在轉(zhuǎn)染過程中罕見細(xì)胞死亡，細(xì)胞形態(tài)、生長狀態(tài)均保持良好。
　　 2.NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表達(dá)細(xì)胞模型的建立
　　 2.1以lipofactaneTM2000和FuGENE(R) HD Tr

10、ansfaction Reagen對SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染T4-NCAM180、T4-NCAM140、T4-NCAM120重組質(zhì)粒，檢測轉(zhuǎn)染48h后蛋白表達(dá)情況，經(jīng)免疫熒光與Western blot法檢測，結(jié)果顯示無NCAM亞型蛋白高表達(dá)。
　　 2.2以FuGENE(R) HD Transfaction Reagen對HEK-293細(xì)胞轉(zhuǎn)染T4-NCAM180、T4-NCAM140、T4-NCAM120重組質(zhì)粒，檢測轉(zhuǎn)染48h

11、后蛋白表達(dá)情況，Western blot檢測結(jié)果顯示HEK-293細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后可高表達(dá)NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120蛋白。
　　 3.低劑量鉛作用對NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120表達(dá)的影響
　　 3.1本研究選取1μM和10μM PbCl2作用于NCAM-180高表達(dá)HEK-293細(xì)胞，結(jié)果顯示染毒12h后兩個劑量組的蛋白表達(dá)均比對照組降低，而染毒24h后蛋白表達(dá)降低得更為明顯

12、；且無論是染毒12h還是24h，10μM Pb2+比1μM Pb2+蛋白表達(dá)降低得更為明顯。
　　 3.2在對NCAM-140高表達(dá)HEK-293細(xì)胞的作用中，12h作用后1μM與10μM組均較對照組NCAM-140表達(dá)要減少，而1μM與10μM組間表達(dá)相差不大，經(jīng)24小時作用后1μM與10μM組NCAM-140表達(dá)較對照組更明顯降低，且10μM組比1μM組的降幅明顯要更大。
　　 3.3在對NCAM-120的影響實驗中

13、，12h作用后鉛1μM與10μM組的表達(dá)量較對照組略有降低，而此降幅不如對NCAM-180和NCAM-14012h作用時明顯。經(jīng)24h作用后兩染毒組NCAM-120表達(dá)量較對照組明顯下降，降幅較12h作用時大，且10μM組的蛋白表達(dá)降低得更為明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1.從轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)情況看，本實驗建立的HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型能夠高表達(dá)NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120。
　　 2.實驗結(jié)