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1、目的:聯(lián)合采用RNA干擾與Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建GR表達(dá)條件性降低的細(xì)胞模型,為在細(xì)胞水平研究GR與腎陽虛證的關(guān)系和進(jìn)行藥物篩選建立平臺,為建立GR條件性降低的基因工程小鼠奠定基礎(chǔ),并觀察溫腎壯陽中藥淫羊藿的單體成分淫羊藿苷對GR表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 方法:聯(lián)合應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)及RNA干擾法建立針對目的基因GR的重組質(zhì)粒,對構(gòu)建的重組質(zhì)粒采用PCR及測序的方法進(jìn)行鑒定,將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒及Cre-ERT2質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠
2、巨噬細(xì)胞RAW264.7,分別用G418及潮霉素B進(jìn)行穩(wěn)定篩選,然后用4-HT誘導(dǎo)Cre-ERT2質(zhì)粒表達(dá),采用RT-PCR及Western blot的方法分別驗證GR在meNA及蛋白水平的表達(dá)情況;用溫腎壯陽的中藥淫羊藿的單體成分淫羊藿苷作用于GR表達(dá)穩(wěn)定降低的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,然后采用RT-PCR及Western blot的方法分別驗證GR在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況,以此來驗證溫腎壯陽中藥的單體成分對GR表達(dá)的調(diào)節(jié)作
3、用。 結(jié)果:成功的構(gòu)建了兩個針對目的基因GR的重組質(zhì)粒,GR在mRNA及蛋白水平的表達(dá)都大大降低。淫羊藿苷作用于GR表達(dá)穩(wěn)定降低的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后,采用RT-PCR及Western blot的方法分別驗證GR在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況,經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計分析,重組質(zhì)粒PBS/U6-Neo-E(E)、PBS/U6-Neo-F(F)與對照相比,GRmRNA表達(dá)有顯著差異(P<0.01);其中重組質(zhì)粒E的GR m
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