GR表達條件性降低細胞模型的建立及淫羊藿苷對GR表達的影響.pdf

1、目的：聯(lián)合采用RNA干擾與Cre-Loxp系統(tǒng)構建GR表達條件性降低的細胞模型，為在細胞水平研究GR與腎陽虛證的關系和進行藥物篩選建立平臺，為建立GR條件性降低的基因工程小鼠奠定基礎，并觀察溫腎壯陽中藥淫羊藿的單體成分淫羊藿苷對GR表達的調節(jié)作用。 方法：聯(lián)合應用Cre-LoxP系統(tǒng)及RNA干擾法建立針對目的基因GR的重組質粒，對構建的重組質粒采用PCR及測序的方法進行鑒定，將構建成功的重組質粒及Cre-ERT2質粒穩(wěn)定轉染小鼠

2、巨噬細胞RAW264.7，分別用G418及潮霉素B進行穩(wěn)定篩選，然后用4-HT誘導Cre-ERT2質粒表達，采用RT-PCR及Western blot的方法分別驗證GR在meNA及蛋白水平的表達情況；用溫腎壯陽的中藥淫羊藿的單體成分淫羊藿苷作用于GR表達穩(wěn)定降低的小鼠巨噬細胞RAW264.7，然后采用RT-PCR及Western blot的方法分別驗證GR在mRNA及蛋白水平的表達情況，以此來驗證溫腎壯陽中藥的單體成分對GR表達的調節(jié)作

3、用。 結果：成功的構建了兩個針對目的基因GR的重組質粒，GR在mRNA及蛋白水平的表達都大大降低。淫羊藿苷作用于GR表達穩(wěn)定降低的小鼠巨噬細胞RAW264.7后，采用RT-PCR及Western blot的方法分別驗證GR在mRNA及蛋白水平的表達情況，經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計分析，重組質粒PBS/U6-Neo-E(E)、PBS/U6-Neo-F(F)與對照相比，GRmRNA表達有顯著差異(P<0.01)；其中重組質粒E的GR m