小麥酯酶的固定化及在有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感檢測中的應(yīng)用.pdf

1、本文對小麥酯酶的提取，分離和純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，對使用溶膠凝膠法對小麥酯酶進(jìn)行固定化進(jìn)行了探索，對使用固定化小麥酯酶膜組裝成的生物傳感電極探頭進(jìn)行了研究，并對兩種常用的有機(jī)磷農(nóng)藥樂果和敵百蟲進(jìn)行了檢測。主要試驗結(jié)果如下：
　　1.小麥酯酶的提取工藝研究。以小麥為原料，采用鹽溶法對小麥酯酶進(jìn)行提取，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，選取中性鹽濃度、提取時間和提取溫度3個因素的3個水平進(jìn)行響應(yīng)面分析

2、。建立小麥酯酶活性的二次回歸模型，得出最佳提取工藝條件，即:NaCl濃度0.164mol/L，提取溫度37.27℃，提取時間101.21min，此條件下酶活的預(yù)測值為3.47×106U/mL，驗證值為3.44×106U/mL。
　　2.小麥酯酶的分離純化工藝研究。結(jié)合使用飽和硫酸銨分級沉淀鹽析法和SephadexG-100凝膠色譜法對提取后的小麥酯酶粗酶液進(jìn)行純化，得出結(jié)論:飽和硫酸銨鹽析分離純化小麥酯酶的最佳濃度范圍為45％～5

3、5％。當(dāng)飽和硫酸銨的濃度為55％時，小麥酯酶的活力最高，為5.25×106U/mL，純化倍數(shù)為1.51倍。經(jīng)SephadexG-100凝膠層析分離純化小麥酯酶的最佳范圍為8～12管。其中11管的酶活最大，為9.30×106U/mL，是純化前小麥酯酶酶活的2.68倍，純化效果明顯。
　　3.小麥酯酶的固定化工藝研究。使用溶膠凝膠法對純化后的小麥酯酶進(jìn)行固定化，經(jīng)篩選溶膠原料，TEOS最適合對小麥酯酶進(jìn)行固定化，其酶活保存率達(dá)到46.

4、50％。之后使用單因素結(jié)合響應(yīng)面的方法，分析出小麥酯酶溶膠凝膠固定化過程中，最佳的條件為:R值8.25，TritonⅩ-100濃度9.84％，PEG-400濃度5.41％和PBS的pH值6.6，此條件下酶活保存率最大，預(yù)測值為56.86％。經(jīng)驗證試驗表明，真實值為57.74％，達(dá)到預(yù)測值的97.76％，結(jié)果與模型高度相符。最后對固定化后的生物敏感膜的特性進(jìn)行測試，得出生物敏感膜在蒸餾水中的溶脹率為5.89％，在丙酮中的溶脹率為2.64％

5、。
　　4.用于檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的生物傳感電極探頭的研究。使用固定化后的小麥酯酶酶膜，將之固定在精密酸度計電極的玻璃探頭部位從而組裝成生物傳感電極探頭，對檢測中涉及到的各項參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得出結(jié)論:每張酶溶膠凝膠傳感膜上最佳小麥酯酶的負(fù)載量為29，溶膠凝膠與小麥酯酶體積比為0.4，進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥檢測時體系中緩沖溶液的pH值為7.0，底物濃度為0.8mmol/L，溫育時間選擇為10min。之后對在農(nóng)業(yè)上使用率最高的兩種有機(jī)磷農(nóng)藥樂果和

6、敵百蟲進(jìn)行了檢測，結(jié)果為:樂果的濃度在1×10-8～1×10-3mol/L內(nèi)與小麥酯酶的抑制率呈線性關(guān)系，回歸方程為y=13.02x+118.7，相關(guān)系數(shù)為0.995，最低檢出限(LDC)為1.7×10-9mol/L;敵百蟲的濃度在1×10-8～1×10-3mol/L內(nèi)與小麥酯酶的抑制率呈線性關(guān)系，回歸方程為y=13.08x+112.7，相關(guān)系數(shù)為0.997，最低檢出限(LDC)為1.1×10-8mol/L。進(jìn)行實際樣品檢測，對照國家標(biāo)