用于海水有機(jī)磷農(nóng)藥監(jiān)測的固定化乙酰膽堿酯酶制備與性質(zhì)研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥(OPs)因其低殘毒、易水解的特性逐漸取代了有機(jī)氯殺蟲劑廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，但農(nóng)藥的大量使用，導(dǎo)致其進(jìn)入河流、湖泊、海洋等各種水體，對環(huán)境產(chǎn)生危害。近岸海域的有機(jī)磷農(nóng)藥污染不僅威脅到海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，最終也會通過食物鏈進(jìn)入人體嚴(yán)重影響人類健康。近些年來，用于農(nóng)藥分析的現(xiàn)場快速檢測方法迅速發(fā)展起來，其中以酶抑制法為基礎(chǔ)的乙酰膽堿酯酶(AChE)傳感器應(yīng)用較為廣泛。AChE的固定化是酶傳感器制作的關(guān)鍵，它決定著酶傳感器的穩(wěn)定性

2、、靈敏度、選擇性和實(shí)際應(yīng)用價值。但常用的載體材料性能不理想，因而不利于酶傳感器的使用和推廣。
　　 殼聚糖(Chitosan, CS)是由甲殼素脫乙酰基得到的線型高分子聚合物，分子結(jié)構(gòu)中存在大量活性氨基和羥基，具有來源廣泛、成本低廉、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，常被作為酶固定化的載體。將其制成殼聚糖微球(Chitosanmicrospheres，CS-MS)，不僅可保留CS原有的性質(zhì)，而且機(jī)械性能將明顯提高，更適于流動注射

3、系統(tǒng)中固定化酶的制備。
　　 本研究以電鰻AChE為生物材料，采用乳液交聯(lián)法制得CS-MS作為酶的載體，然后以戊二醛(GA)為交聯(lián)劑，采用共價交聯(lián)法進(jìn)行AChE的固定，研究各種固定條件對酶活回收率的影響，確定適宜的固定條件：將1gCS-MS用5ml.0.5％(v/v)的GA活化0.25h后，然后將其投入含0.75U的AChE、pH7.07.5的PBS中反應(yīng)24h，此條件下制備的固定化AChE酶活回收率達(dá)81.94％，優(yōu)于國內(nèi)外同

4、類研究結(jié)果。通過設(shè)計正交試驗(yàn)，以酶活回收率為評價指標(biāo)，并綜合考慮微球的物理性能，優(yōu)化了CS-MS的制備條件，研究發(fā)現(xiàn)水油相體積比1:4、攪拌速度700r/min、分散時間1h、GA用量0.5ml、交聯(lián)時間0.5h時，制備的微球機(jī)械性能和固定酶效果較好。
　　 另外，紅外光譜結(jié)果表明，AChE與載體結(jié)合過程中，微球上懸掛-CHO與酶-NH2之間通過共價反應(yīng)生成Schiff堿，同時微球上C6-OH與酶-NH2還能夠形成氫鍵。掃描電鏡

5、觀察顯示，CS-MS基本呈球形，具有錯綜復(fù)雜的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)GA活化的微球表面相對平整光滑，有利于酶的固定。
　　 固定化AChE在海水體系中表現(xiàn)出良好的適應(yīng)能力，固定化酶的適宜溫度較溶液酶向高溫方向移動，適宜pH范圍未發(fā)生移動，抗鹽能力略有提高。且固定化酶熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性明顯優(yōu)于溶液酶，固定化酶在4℃磷酸鹽緩沖溶液中保存60d后活力僅損失17％。同時固定化過程使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生一定改變，產(chǎn)生了空間立體障礙或擴(kuò)散阻力，

6、米氏常數(shù)由8.157mmol/L提高到46.18mmol/L，降低了酶與底物的親和力。
　　 將本研究中制備的固定化AChE作為生物識別元件，對海水中OPs的監(jiān)測研究進(jìn)行初步探索。結(jié)果表明，農(nóng)藥濃度100μg/L，抑制溫度30℃時，甲基對硫磷、馬拉硫磷、毒死蜱三種OPs對固定化AChE的最佳抑制時間為分別為30、20、20min，同時確定固定化酶對農(nóng)藥的響應(yīng)規(guī)律，其對三種OPs的檢測下限分別為5.34、5.75、5.95μg/L

7、。因此，以固定化AChE最為敏感的甲基對硫磷作為參比農(nóng)藥，確定單位毒性當(dāng)量為5.63μg/L，并采用毒性當(dāng)量法評價海水樣品中農(nóng)藥的綜合污染水平。
　　 綜上所述，以殼聚糖微球?yàn)檩d體制備固定AChE，酶活回收率較高，機(jī)械性能良好，且其來源豐富，因而是一種很有潛力的AChE固定載體。固定化酶在海水體系中具有良好的酶學(xué)性能，對于有機(jī)磷農(nóng)藥具有響應(yīng)快、靈敏度高等特點(diǎn)，并且毒性當(dāng)量評價方法方便快速，由參比農(nóng)藥求出的毒性當(dāng)量值更能反映農(nóng)藥的