RNA干擾STAT3基因?qū)θ四z質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響.pdf

1、背景與目的 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是膠質(zhì)瘤發(fā)生的始動細(xì)胞，是其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根本原因。由膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化而來的其它非成瘤腫瘤細(xì)胞只有有限的增殖潛能，不具有致瘤能力。以膠質(zhì)瘤干細(xì)胞為治療靶細(xì)胞更可能取得對人惡性膠質(zhì)瘤治療的成功。研究顯示，腫瘤干細(xì)胞較腫瘤內(nèi)其它非成瘤腫瘤細(xì)胞對放療、化療更為抗拒。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞有著密切聯(lián)系和諸多共同之處，缺乏特異性分子標(biāo)志的表達(dá)，這也為分子靶向治療帶來很大困難。STAT3在胚胎發(fā)育中胚胎干細(xì)胞多能性的

2、維持中起著重要作用。同時它又與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系，被認(rèn)為是一個癌基因。Star3的持續(xù)活化可以使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡因子等的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和對抗凋亡。通過當(dāng)前腦腫瘤干細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法我們獲得了一些啟示。當(dāng)前在人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)中均采用加入LIF等的無血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液。LIF是JAK/STAT3信號途徑的重要刺激因子。故我們推測STAT3基因在人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖和分化中可能發(fā)揮重要作用。

3、為此，本研究擬在分離、純化和鑒定人惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，構(gòu)建并包裝可表達(dá)STAT3基因特異性siRNA的慢病毒載體病毒，感染膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后阻斷STAT3基因的表達(dá)，觀察其對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響。 方法 1．分離并鑒定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞：采用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法分離、純化人惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測膠質(zhì)瘤干細(xì)胞CD133、GFAP、MAP2和MBP的表達(dá)；有限梯度稀釋實驗、二代球體形成分析、流式細(xì)胞分析確定膠質(zhì)

4、瘤干細(xì)胞所占比例和其自我更新能力；分化實驗確定其多能分化能力；增殖測定觀察增殖能力；裸鼠移植瘤實驗，觀察膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成瘤能力。 2．制備STAT3 siRNA載體病毒：構(gòu)建STAT3 RNA干擾慢病毒載體；pSC-shSTAT3，pCMV-dR8.74，pMD2G共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，收集可表達(dá)STAT3特異性siRNA慢病毒載體的病毒顆粒pSC-LT；流式細(xì)胞分析測定載體病毒對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的感染效率；pSC-LT感染膠質(zhì)瘤干

5、細(xì)胞后，Realtime Q-PCR和Westernblot檢測細(xì)胞STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平，了解pSC-LT對STAT3基因的干擾效率。 3．觀察膠質(zhì)瘤干細(xì)胞感染pSC-LT后的增殖、分化：細(xì)胞增殖試劑盒測定細(xì)胞生長曲線；流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期分布改變；流式細(xì)胞分析及免疫熒光觀察CD133<'+>膠質(zhì)瘤干細(xì)胞比例；裸鼠移植瘤實驗觀察細(xì)胞成瘤能力變化。 4．膠質(zhì)瘤干細(xì)胞感染pSC-LT后細(xì)胞凋亡檢測：流式細(xì)胞分析

6、、熒光染色觀察感染后細(xì)胞凋亡情況；Realtime Q-PCR和Westernblot檢測細(xì)胞感染前后凋亡相關(guān)基因表達(dá)。 結(jié)果 3例患者原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CD133<'+>細(xì)胞分別為7.4％，2.8％，4.2％。每100個原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可形成1個左右的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球；膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球細(xì)胞均表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記CD133，不表達(dá)分化標(biāo)志GFAP、MAP2，少數(shù)細(xì)胞表達(dá)分化標(biāo)記MBP。每100個原代膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球細(xì)胞可形成6

7、.07±2.15個懸浮生長的二代膠質(zhì)瘤細(xì)胞球，二代干細(xì)胞球細(xì)胞表達(dá)CD133。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球細(xì)胞分化后細(xì)胞多數(shù)表達(dá)GFAP、少數(shù)表達(dá)MAP2、MBP。膠質(zhì)瘤球體干細(xì)胞的增殖較原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞慢。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞1×10<'3>個時可成瘤，原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞需1×10<'7>個。 載體病毒pSC-LT、pSC-LC對惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的感染效率均為98.6％。pSC-LT載體病毒感染組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞STAT3 mRNA水平較未感染組和陰性

8、對照pSC-LC病毒感染組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞顯著下降(P<0.01)，抑制率為84.3％。Westernblot檢測顯示pSC-LT感染組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞較未感染組細(xì)胞Stat3蛋白下降81.5％，pStat3下降97.9％。 與陰性對照病毒感染細(xì)胞比較，pSC-LT感染組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液中由懸浮球狀生長變?yōu)橘N壁生長，增殖變慢，細(xì)胞周期分析顯示G1期比例顯著增高(P<0.05)，CD133<'+>細(xì)胞由92.2％下降至5.7

9、％(P<0.01)。pSC-IT感染組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在1×10<'4>個細(xì)胞/只接種裸鼠后均未成瘤，致瘤能力較陰性對照病毒pSC-LC感染組和未感染膠質(zhì)瘤干細(xì)胞顯著下降。 流式細(xì)胞分析顯示pSC-LT感染組細(xì)胞的凋亡率為16％，較pSC-LC感染組(3.2％)、未感染組(2％)顯著增高(P<0.05)。Realtime Q-PCR．和Weaternblot檢測顯示pSC-LT感染組細(xì)胞較pSC-LC感染組和未感染組Bcl-2 mR

10、NA和蛋白表達(dá)水平下降，BAX、Caspase-3基因表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。 結(jié)論 1．我們采用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法成功分離了人惡性腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，并對其多能性和自我更新能力等進(jìn)行了鑒定。 2．利用慢病毒siRNA表達(dá)載體pSC-GFP構(gòu)建、包裝的STAT3基因特異性siRNA表達(dá)載體病毒pSC-LT對人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有很高的感染效率，感染膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后可顯著的抑制細(xì)胞STAT3蛋自表達(dá)和活化。