椎體軟骨終板退變的實驗研究.pdf

1、第一部分內(nèi)皮素-1與人腰椎間盤軟骨終板退變的相關(guān)性研究
　　目的:探討內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)導(dǎo)致軟骨終板發(fā)生退變的機制。
　　方法:按改良的Pfirrmann分型確定椎間盤退變程度，選取8例腰椎退行性病變作為研究對象（退變終板），另外8例腰椎爆裂性骨折病例作為對照研究（正常終板）。在進行腰椎融合手術(shù)時取出軟骨終板，對標本進行大體觀察和H&E染色，以及通過免疫組織化學(xué)染色和Western blotti

2、ng的方法分析ET-1在退變和正常終板中的表達情況。
　　應(yīng)用Ⅱ型膠原酶消化法分離培養(yǎng)人退變終板軟骨細胞(CECs)，采取H&E、甲苯胺藍及免疫組織化學(xué)染色（Ⅱ型膠原和蛋白聚糖）對軟骨終板細胞進行鑒定。通過免疫熒光法分析軟骨終板細胞ET-1表達情況。腫瘤壞死因子alpha(TNF-α，0-100ng/ml)作用軟骨終板細胞，24小時后進行Real-time PCR從mRNA水平和36小時后進行Western blotting從蛋白

3、水平分析軟骨終板細胞的ET-1表達情況。使用不同劑量的ET-1(0-100nM)作用體外培養(yǎng)的軟骨終板細胞，36小時后通過ELISA方法分別檢測培養(yǎng)細胞的上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶-1、13(MMP-1和MMP-13)和組織金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）含量;以及36小時后通過一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)試劑盒測定細胞上清液中NO含量和NOS活性;72小時后通過AnnexinⅤ-FITC法分析軟骨終板細胞凋亡情況。

4、>　　結(jié)果:正常軟骨終板為透明軟骨，終板細胞的形態(tài)近似圓形，細胞外基質(zhì)均勻、有層次感;退變軟骨終板呈現(xiàn)纖維化、骨化，并且出現(xiàn)破裂，部分出現(xiàn)細胞核溶解，伴有血管侵犯。免疫組化顯示，在退變軟骨終板內(nèi)ET-1表達為強陽性，定位于終板細胞的胞漿內(nèi);而正常終板僅為弱陽性。通過Western blotting分析，ET-1在退變軟骨終板內(nèi)含量明顯高于正常終板。
　　成功進行了CECs原代和傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察，原代細胞12-24小時貼壁

5、，48小時后細胞開始增殖，約7天出現(xiàn)細胞集落，約14天鋪滿培養(yǎng)皿，細胞形態(tài)多樣，從梭形到多邊型不等。H&E染色顯示細胞呈多角形，伴有圓形或橢圓形的細胞核;甲苯胺藍染色可見終板細胞質(zhì)有藍色異染出現(xiàn);免疫組化染色顯示人軟骨終板細胞特征性表達Ⅱ型膠原和蛋白聚糖（定位于細胞質(zhì)），所以從細胞形態(tài)、生長情況及細胞表型類似于關(guān)節(jié)軟骨細胞。細胞免疫熒光染色顯示退變軟骨終板細胞表達ET-1，綠色熒光顯示分泌型顆粒位于細胞質(zhì)內(nèi)。無論是Real-timePC

6、R還是Western blotting結(jié)果都顯示TNF-α可以促使CECs表達ET-1，呈劑量遞增關(guān)系。ET-1作用軟骨終板細胞后，隨著ET-1劑量的增加，細胞上清液中MMP-1和MMP-13水平增高，后者比前者增加明顯，而TIMP-1水平呈下降趨勢。NO含量也隨著ET-1呈劑量遞增，同時伴有NOS活性增強。不同劑量的ET-1并沒有誘使軟骨終板細胞凋亡增加。
　　結(jié)論:退變的軟骨終板組織內(nèi)有高含量的ET-1表達。軟骨終板細胞表達E

7、T-1，受到前炎癥因子TNF-α的調(diào)節(jié)。ET-1是軟骨終板退變過程中重要的炎癥介質(zhì)，它通過促使CECs分泌MMP-1、MMP-13和NO從而導(dǎo)致軟骨終板退變。
　　第二部分大鼠尾椎終板下缺血模型的制作
　　目的:探討經(jīng)皮穿刺大鼠尾椎椎間盤終板下骨質(zhì)，注射無水酒精導(dǎo)致椎間盤退變的可能性。
　　方法:選取3月齡SD大鼠40只，其中8只無任何處理獲取正常椎間盤組織。設(shè)第八尾椎(Co8)為實驗組，相對應(yīng)的椎間盤是Co7/Co8

8、; Co9為對照組，對應(yīng)的椎間盤是Co8/Co9。在X-ray透視機器輔助下，距離終板2-3mm處，使用直徑0.7mm(＃7)的腰椎穿刺針進行椎體局部穿刺至骨髓腔，連接1mL注射器針管加壓注入30μl無水酒精破壞終板下的骨質(zhì)微循環(huán);而Co9注射磷酸鹽緩沖液(PBS)作為對照。術(shù)后第1、2、3和4月隨機選取8只大鼠，在麻醉狀態(tài)下行X線攝像觀察椎間隙高度變化。退變的椎間盤通過不同的化學(xué)染色進行如下觀察，蘇木精-伊紅(H&E)觀察椎間盤的細胞

9、形態(tài)變化;番紅O-固綠染色顯示終板軟骨的骨化程度;番紅O染色觀察椎間盤的黏多糖(glycosaminoglycan，GAG)變化情況，以及終板潮線(tidemark)結(jié)構(gòu)的深淺程度;甲苯胺藍染色主要觀察終板軟骨基質(zhì)的異染性。免疫組織化學(xué)染色分別檢測Ⅱ型膠原、蛋白聚糖，和Sox-9表達情況。
　　結(jié)果:與對照組相比，無水酒精注射后第2個月出現(xiàn)椎間盤高度逐漸降低，以到第4個月時為重。X線提示術(shù)后第3和4個月時實驗組終板處出現(xiàn)骨質(zhì)硬化伴

10、有增生。H&E染色顯示終板的生長板(growth plate)隨著觀察時間的延長，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損，終板軟骨細胞退變、甚至消失，終板鈣化直至骨化表現(xiàn);髓核內(nèi)細胞的性質(zhì)發(fā)生改變，從第1個月到第2個月空泡樣細胞逐漸增多，術(shù)后第3個月轉(zhuǎn)變?yōu)檐浌菢蛹毎?，?個月隨著髓核的纖維化，殘存的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維軟骨樣細胞。隨著退變的加重，纖維環(huán)出現(xiàn)排列紊亂及板層粗糙、以至斷裂和纖維化。番紅O-固綠染色顯示實驗側(cè)終板骨化程度逐漸加重，尤以術(shù)后第3、4個月時為甚。

11、番紅O染色顯示，從術(shù)后第1個月開始，生長板處波浪狀的潮線顏色變淺，隨著終板結(jié)構(gòu)的破壞，潮線結(jié)構(gòu)破壞、逐至消失。此外，番紅O染色逐漸變淺提示髓核基質(zhì)中黏多糖的含量逐漸降低。甲苯胺藍染色代表的終板軟骨基質(zhì)顏色逐漸變淺，表示向骨性終板轉(zhuǎn)化。缺血側(cè)的終板Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性程度逐漸下降;而髓核Ⅱ型膠原陽性染色程度保持不變或有所增強，其中術(shù)后第4個月時著色較淺，為弱陽性。除在第3個月呈短暫增高外，聚集蛋白聚糖(aggrecan)免疫組織化學(xué)陽