誘導(dǎo)異種核移植來源的胚胎干細(xì)胞（rhSCNT-ESCs）向造血分化.pdf

1、第一部分：異種核移植來源的胚胎干細(xì)胞(rhSCNT-ESCs)分化為造血干細(xì)胞 研究目的：rhSCNT-ESCs來源于移植人體細(xì)胞核入去核的兔卵母細(xì)胞中，因而具有與供體細(xì)胞一致的基因類型。本項研究采用不同的誘導(dǎo)條件，通過流式分析與免疫染色比較，旨在探索rhSCNT-ESCs的定向誘導(dǎo)造血方案，為下一步的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。研究方法： (1)本研究嘗試使用MEF、F陰1BM來源的基質(zhì)細(xì)胞為飼養(yǎng)層，將其與rhSCNT-ES細(xì)

2、胞共培養(yǎng)，流式檢測培養(yǎng)不同時間段CD34<'+>細(xì)胞百分含量。 (2)采用分階段誘導(dǎo)造血法，將傳代的rhSCNT-ES細(xì)胞微團(tuán)接種于低粘附六孔板中，添加不同組合的生長因子，選取不同階段的細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。 研究結(jié)果： (1)不添加任何外源性細(xì)胞因子，rhSCNT-ESCs與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，在第3～4天出現(xiàn)造血細(xì)胞簇，第14天可見造血集落CFU-GEMM。體外培養(yǎng)過程中，CD34<'+>細(xì)胞百分比逐漸增加，三組均在

3、第7天達(dá)峰。MEF共培養(yǎng)組ES細(xì)胞造血分化能力較弱，與另外兩組相比有顯著差異。BMSC及FLSC飼養(yǎng)層支持ES細(xì)胞向造血分化的能力相近，CD34<'+>細(xì)胞百分比在第7天與第14天出現(xiàn)兩個峰值。 (2)rhSCNT-ES細(xì)胞微團(tuán)在分化培養(yǎng)液中2天可觀察到簡單擬胚體細(xì)胞團(tuán)生成，4天時生成的囊狀擬胚體直徑約有100-15μm，大小基本均一。將第一階段的EBs消化成單細(xì)胞后種植在甲基纖維素培養(yǎng)基中，3～4天后第一階段添加中胚層誘導(dǎo)因子

4、BMP<,4>的第4，5組可觀察到明顯的呈集落狀生長的細(xì)胞。此時的細(xì)胞CD34及KDR抗體免疫染色呈陽性。 結(jié)論：本實驗采用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)獲得的rhsCNT-ESCs，分別采用2種不同的誘導(dǎo)途徑，篩選出支持rhSCNT-ESCs高效向造血分化的飼養(yǎng)層細(xì)胞與細(xì)胞因子組合。第二部分：臍血造血干細(xì)胞擴(kuò)增后重建造血功能 研究目的：本項工作采用不同的生長因子組合，通過流式分析比較，旨在探索臍血造血干細(xì)胞的體外高效擴(kuò)增條件，并

5、進(jìn)一步確定擴(kuò)增后細(xì)胞的體內(nèi)重建造血能力，為下一步造血干細(xì)胞的臨床移植奠定基礎(chǔ)。 研究方法： (1)采用Easys印免疫磁珠陽性選擇系統(tǒng)分離新鮮臍血中的cD34<'+>細(xì)胞，流式檢測其純度達(dá)到94.10％。在無血清、無基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加3種不同的生長因子組合，分別于第7天及第14天計算細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。 (2)取擴(kuò)增7天的臍血細(xì)胞置于半固體培養(yǎng)體系，觀察造血集落形成；將擴(kuò)增后細(xì)胞自尾靜脈注射入265cGy輻照的6周

6、齡scID小鼠體內(nèi)，6周后檢測其骨髓中的人源細(xì)胞，并進(jìn)行造血集落培養(yǎng)。 研究結(jié)果： (1)在無血清、無基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加細(xì)胞因子scF+TPO+FL+IL-3，自第3天起細(xì)胞數(shù)量開始逐漸增加，至第7～8天時細(xì)胞擴(kuò)增明顯。第7，14天細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增達(dá)80.38±1.24及384.40±17.48倍，顯著高于另外2組；隨著時間的推移，cD34<'+>細(xì)胞百分含量逐漸下降至2.29％，但其數(shù)目于第7天達(dá)到高峰，擴(kuò)增倍數(shù)

7、 (2)擴(kuò)增7天的臍血細(xì)胞在甲基纖維素培養(yǎng)基中第6～8天為集落形成高峰，依次出現(xiàn)粒系、混合系造血集落，Wright’s染色可見髓系、單核系細(xì)胞。將擴(kuò)增后細(xì)胞移植入scID小鼠體內(nèi)，6周后流式檢測其骨髓中的cD45<'+>細(xì)胞為11.31％，RT-PcR分析可見387bp的人β-actin；接種于半固體培養(yǎng)基中，可以觀察到混合系造血集落形成。 結(jié)論：造血干細(xì)胞移植具有廣泛的臨床應(yīng)用潛能，本實驗篩選出臍血造血干細(xì)胞的體外高效擴(kuò)增