MUC1多肽致敏樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CTLs體外殺傷白血病細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 1．應(yīng)用GM-CSF、IL-4及CD40L等多種細(xì)胞因子從健康志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)出樹突狀細(xì)胞(DC)，并通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞免疫表型檢測等對DCs進(jìn)行鑒定。2．以急性單核細(xì)胞白血病IJ937細(xì)胞株及急性紅白血病K562細(xì)胞株為研究對象，應(yīng)用RT—PCR檢測兩種細(xì)胞中MUCl的表達(dá)水平。3．DCs體外負(fù)載MUCl多肽抗原及白血病細(xì)胞凍融抗原，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，觀察CTL。對白血病U937及K5

2、62細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)。 方法：1．細(xì)胞培養(yǎng)：(1)樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)：采集健康人外周血，分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，加入含rhGM-CSF、rhIL-4及L-谷氨酰胺的小牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，第5d收集懸浮細(xì)胞后與rhTNF-α及rhsCD40L共同孵育，第7d收獲細(xì)胞。對照組的細(xì)胞培養(yǎng)方法同上，但不添加任何細(xì)胞因子。(2)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：分別收集方法中第一步獲得的非貼壁自體和異體單個(gè)核細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含rh

3、IL-2及rhINF-γ)，每2-3d半量換液，培養(yǎng)7d后收獲；(3)U937及K562細(xì)胞培養(yǎng)：K562、U937細(xì)胞用含10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液在5％CO<,2>飽和濕度、37℃條件下培養(yǎng)，每2-3天換液，細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)傳代。 2．細(xì)胞鑒定及表型分析：(1)樹突狀細(xì)胞：在倒置相差顯微鏡下觀察，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記。(2)淋巴細(xì)胞：選用CD3、CD4、CD8、CD28及CD56等熒光抗體，流式細(xì)胞儀檢

4、測實(shí)驗(yàn)組(DC加異體淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組)和對照組(未誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞加異體淋巴細(xì)胞)。 3．RT-PCR方法檢測U937及K562細(xì)胞中MUC1的表達(dá)水平。4．致敏樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CTL對白血病細(xì)胞的殺傷作用檢測：實(shí)驗(yàn)組用MUCl多肽抗原(A組)或白血病細(xì)胞凍融抗原(B組)沖擊致敏DC后+異體淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性CTL；對照組應(yīng)用未致敏DC(A組)或單核細(xì)胞(B組)+異體淋巴細(xì)胞；應(yīng)用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測細(xì)胞毒作用。

5、 結(jié)果：1．樹突狀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：培養(yǎng)24h后可見貼壁細(xì)胞及少量懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大，第5天可見細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則形，偽足樣突起增多。第7天可見細(xì)胞表面樹枝狀突起，瑞氏染色下可見細(xì)胞體積較大，呈圓或橢圓形，表面有毛刺樣、扁平狀突起，部分可見核仁，同時(shí)可見部分破碎細(xì)胞漂浮聚集，有少數(shù)死亡細(xì)胞。2．流式細(xì)胞儀表型檢測：(1)經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，CD86、CD40的表達(dá)水平均在90％以上， CD80為70％左

6、右，CDla平均為60％左右， CD83平均為40％，而單核細(xì)胞特征性標(biāo)志CD14在5％以下，表明經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后絕大部分單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)變成了DCs。(2)淋巴細(xì)胞中活化T細(xì)胞免疫表型分析：與對照組相比，經(jīng)DC激發(fā)的T細(xì)胞有上調(diào)CD3、CD8、CD28、CD56等膜表面分子的作用。 3．RT-PCR檢測結(jié)果：U937和K562細(xì)胞中均不同程度的表達(dá)MUC1，其中U937細(xì)胞中MUCl的表達(dá)強(qiáng)于K562細(xì)胞。4．致敏DC誘導(dǎo)CTLs細(xì)胞毒作

7、用的觀察：無論是實(shí)驗(yàn)組還是對照組，隨著效靶比的增加，細(xì)胞的殺傷效應(yīng)也明顯增加(P<0.05或P<0.01)。在任何一個(gè)固定的效靶比例下，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的殺傷率均明顯高于對照組(P<0.01)；以上結(jié)果表明經(jīng)抗原致敏的DCs能顯著增強(qiáng)CTLs對U937及K562細(xì)胞的殺傷作用。 結(jié)論：1．通過聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、：rhTNF- α及rhsCD40L等由健康人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)活化出DC，倒置

8、顯微鏡觀察具有典型樹突狀形態(tài)特征；流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)高水平的共刺激分子，表明經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)得到的DC具有極強(qiáng)的免疫原性。2．通過聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子rhIL-2、rhINF-γ等誘導(dǎo)培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，并與DC共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測CD3<'+>CD8<'+>、CD3<'+>CD28<'+>、CD3<'+>CD8<'+>CD28<'+>及CD3<'+>CD56<'+>細(xì)胞群有所增加。3．U937和K562均不同水平的表達(dá)MUCl。4．DC體外負(fù)載