難治性癲癇患者腦溶酶體、線粒體及突觸功能相關(guān)基因異常表達.pdf

1、神經(jīng)元異常放電是癲癇的病變基礎(chǔ)，而神經(jīng)元異常放電其根本往往與基因的表達異常有關(guān)。而基因表達異常引起的線粒體、溶酶體代謝紊亂、突觸功能異常、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和環(huán)路的重組等導(dǎo)致異常突觸形成，抗癲癇藥物作用位點喪失且避開體內(nèi)起抑制作用的生理屏障，因此患者反復(fù)癇性發(fā)作，并出現(xiàn)多種一線抗癲癇藥作用無效。因此研究基因的異常表達對尋找難治性癲癇發(fā)病機制具有非常重要的意義。 目的 研究癲癇、難治性癲癇患者腦細胞線粒體功能相關(guān)基因線粒

2、體蘋果酸脫氫酶(mitochondrial malate dehydrogenase，mMDH)、NADH泛醌脫氫酶FC2(NADH dehydrogenase ubiquinone FC2，NDUFC2)；突觸功能相關(guān)基因突觸后密度(postsynaptic density，PSD)-93、N-甲基-D-天門冬氨酸受體亞單位2B(N-methyl-D-aspartate receptors subunit 2B，NR2B)以及溶酶體組

3、織蛋白酶D(cathepsin D，Cath D)的表達，探索其在難治性癲癇發(fā)病機制中的作用。 方法 分別隨機選取48例難治性癲癇、8例非難治性癲癇及8例對照組腦組織標(biāo)本，提取其總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用基因芯片對其進行掃描，隨后用熒光定量PCR(fluorescence quantitative polymerasechain reaction，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)驗證mMDH、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverset

4、ranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)驗證PSD-93、NR2B、Cath D的表達，并再次在腦庫中隨機抽取對照組標(biāo)本，增加對照組的樣本含量后，對Cath D進行免疫組化和免疫熒光檢測。 結(jié)果 基因芯片發(fā)現(xiàn)mMDH、NDUFC2、Cath D在難治性癲癇中顯著下調(diào)，其Cy5/Cy3*值分別為0.349、0.373、0.433，而PSD-93在難治性癲癇及癲癇中均表達上

5、調(diào)Cy5/Cy3*值分別為2.124、5.550。mMDH的FQ-PCR及PSD-93、Cath D的RT-PCR結(jié)果與基因芯片一致(p<0.05)，RT-PCR實驗中NR2B在難治性癲癇及癲癇中表達均顯著上調(diào)(p<0.05)。免疫組化測定發(fā)現(xiàn)難治性癲癇組海馬和顳葉組織神經(jīng)元可見極少量的棕褐色染色；正常對照組海馬和顳葉組織神經(jīng)元染色非常明顯。免疫熒光示Cath D主要在神經(jīng)元胞體表達，膠質(zhì)細胞未見表達。免疫組織化學(xué)顯示其在難治性癲癇顳葉

6、和海馬中的表達(0.0609±0.03550，0.0688±0.02500)顯著低于對照組(0.1542±0.02234，0.1667±0.02082，P<0.01)，免疫熒光結(jié)果趨勢與之一致(P<0.05)。各組內(nèi)顳葉與海馬間Cath D表達無差異(P>0.05)。 結(jié)論 基因芯片在篩選癲癇及難治性癲癇相關(guān)基因的改變時，具有快速、高通量、高靈敏度等特點，但其假陽性和假陰性結(jié)果可能導(dǎo)致實驗偏差，因此用其它方法進行驗證具有

7、必要性。 能量代謝紊亂，離子通道的異常均與癲癇及難治性癲癇的發(fā)病機制密切相關(guān)。神經(jīng)元壞死或凋亡，異常突觸連接形成，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組及正常藥物作用位點喪失，這些均可能導(dǎo)致難治性癲癇的形成。 mMDH、NDUFC2的下調(diào)可能與線粒體能量代謝紊亂有關(guān)，而線粒體代謝紊亂，不僅可以導(dǎo)致多種神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙，通過一系列級聯(lián)反應(yīng)引起癇性發(fā)作，而且還可引起神經(jīng)元壞死或凋亡。 PSD-93、NR2B的表達上調(diào)可能放大了突觸的興奮性效果