含hTK1和hTIMP1雙基因載體的構(gòu)建及在大鼠血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá).pdf

1、目的：
　　據(jù)研究表明,基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP1)對細(xì)胞外基質(zhì)形成具有重要作用;本課題前期研究發(fā)現(xiàn)含人組織激肽釋放酶1(hTK1)基因過表達(dá)具有部分抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和改善血管再狹窄的作用,但兩者聯(lián)合應(yīng)用時對血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及血管重塑是否具有協(xié)同效應(yīng)或疊加效應(yīng),目前尚未明了。本課題首先構(gòu)建含基因hTK1和hTIMP1雙基因共表達(dá)的重組腺病毒載體,并觀察目的基因在大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)中表達(dá)情況。

2、
　　方法：
　　第一部分：
　　1.購買含hTIMP1基因的原始質(zhì)粒,經(jīng)鑒定其正確性后,采用酶切、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收、連接酶切產(chǎn)物,經(jīng)熱休克等克隆構(gòu)建含強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)和hTIMP1的重組穿梭質(zhì)粒,并鑒定其正確性。
　　2.選擇相應(yīng)內(nèi)切酶位點(diǎn),對含hTIMP1基因的重組質(zhì)粒和pDC316-hTK1質(zhì)粒(本研究室保存)進(jìn)行酶切并擴(kuò)增目的基因片段,將兩者PCR產(chǎn)物回收、連接、熱休克法轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌和

3、挑取克隆,構(gòu)建含hTK1和hTIMP1雙基因的重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR、酶切分析和測序方法鑒定其正確性。
　　3.將重組質(zhì)粒線性化,并同骨架病毒質(zhì)粒pBHGloxE1,3Cre于293A細(xì)胞中包裝,經(jīng)包裝獲得重組腺病毒,用TICD50法測定病毒滴度。
　　第二部分：
　　1.采用組織貼塊法原代培養(yǎng)來自Sprague-Dawley(SD)大鼠胸主動脈VSMCs,經(jīng)鑒定后,選取3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用三種重組腺病毒(Ad5-EG

4、FP、Ad5-hTIMP1-EGFP與Ad5-hTK1-hTIMP1)感染細(xì)胞,分別以不同感染復(fù)數(shù)(MOI)和不同感染時間,觀察目的基因的表達(dá)情況。
　　2.Real-Time PCR法測目的基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。
　　3.Western Blot法檢測目的蛋白表達(dá)。
　　4.細(xì)胞免疫熒光法檢測目的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)PCR、酶切和測序分析結(jié)果,重組質(zhì)粒pDC316-hTIMP1-EGFP和pD

5、C316-hTK1-hTIMP1構(gòu)建正確,在293A細(xì)胞中成功包裝重組腺病毒Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1,其滴度分別為7.0×1011vp/ml和8.5×1011vp/ml。
　　2.Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后,Real-TimePCR法檢測目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的mRNA水平呈現(xiàn)高表達(dá),并呈現(xiàn)感染復(fù)數(shù)(50-150MOI)

6、和時間(1-3d)依賴性增加。
　　3.Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后,Wester-blot法檢測目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的蛋白呈現(xiàn)高表達(dá),并呈現(xiàn)感染復(fù)數(shù)(50-100MOI)依賴性增加。
　　4.Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后,細(xì)胞免疫熒光方法檢測發(fā)現(xiàn)目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的蛋白呈現(xiàn)表