含hTK1和hTIMP1雙基因載體的構建及在大鼠血管平滑肌細胞的表達.pdf

1、目的：
　　據研究表明,基質金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP1)對細胞外基質形成具有重要作用;本課題前期研究發(fā)現(xiàn)含人組織激肽釋放酶1(hTK1)基因過表達具有部分抑制血管平滑肌細胞增殖和改善血管再狹窄的作用,但兩者聯(lián)合應用時對血管平滑肌細胞增殖、遷移及血管重塑是否具有協(xié)同效應或疊加效應,目前尚未明了。本課題首先構建含基因hTK1和hTIMP1雙基因共表達的重組腺病毒載體,并觀察目的基因在大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)中表達情況。

2、
　　方法：
　　第一部分：
　　1.購買含hTIMP1基因的原始質粒,經鑒定其正確性后,采用酶切、PCR擴增及產物回收、連接酶切產物,經熱休克等克隆構建含強綠色熒光蛋白(EGFP)和hTIMP1的重組穿梭質粒,并鑒定其正確性。
　　2.選擇相應內切酶位點,對含hTIMP1基因的重組質粒和pDC316-hTK1質粒(本研究室保存)進行酶切并擴增目的基因片段,將兩者PCR產物回收、連接、熱休克法轉染感受態(tài)大腸桿菌和

3、挑取克隆,構建含hTK1和hTIMP1雙基因的重組質粒,經PCR、酶切分析和測序方法鑒定其正確性。
　　3.將重組質粒線性化,并同骨架病毒質粒pBHGloxE1,3Cre于293A細胞中包裝,經包裝獲得重組腺病毒,用TICD50法測定病毒滴度。
　　第二部分：
　　1.采用組織貼塊法原代培養(yǎng)來自Sprague-Dawley(SD)大鼠胸主動脈VSMCs,經鑒定后,選取3-5代細胞進行實驗。用三種重組腺病毒(Ad5-EG

4、FP、Ad5-hTIMP1-EGFP與Ad5-hTK1-hTIMP1)感染細胞,分別以不同感染復數(shù)(MOI)和不同感染時間,觀察目的基因的表達情況。
　　2.Real-Time PCR法測目的基因的轉錄水平表達。
　　3.Western Blot法檢測目的蛋白表達。
　　4.細胞免疫熒光法檢測目的蛋白表達。
　　結果：
　　1.經PCR、酶切和測序分析結果,重組質粒pDC316-hTIMP1-EGFP和pD

5、C316-hTK1-hTIMP1構建正確,在293A細胞中成功包裝重組腺病毒Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1,其滴度分別為7.0×1011vp/ml和8.5×1011vp/ml。
　　2.Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后,Real-TimePCR法檢測目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的mRNA水平呈現(xiàn)高表達,并呈現(xiàn)感染復數(shù)(50-150MOI)

6、和時間(1-3d)依賴性增加。
　　3.Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后,Wester-blot法檢測目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的蛋白呈現(xiàn)高表達,并呈現(xiàn)感染復數(shù)(50-100MOI)依賴性增加。
　　4.Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1感染VSMCs后,細胞免疫熒光方法檢測發(fā)現(xiàn)目的基因hTIMP1及hTK1-hTIMP1的蛋白呈現(xiàn)表