TAT-血紅素氧合酶-1融合蛋白對大鼠供肝冷保存期氧化和炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、目的：原位肝移植現(xiàn)已廣泛用于終末期肝病治療，有研究報(bào)導(dǎo)術(shù)后1年60-65％發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。其主要原因之一是供肝冷保存期氧化和炎性損傷。目前由于供肝資源緊缺，如何有效保護(hù)供肝，減少移植肝臟的無功能的發(fā)生率更加受到了人們的重視。HO-1蛋白是機(jī)體血紅素分解代謝的限速酶，分解產(chǎn)生一氧化碳（CO）、膽綠素和Fe2+，具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡、下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子表達(dá)、減少血管損傷、增加移植器官的血流灌注等作用，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛

2、關(guān)注。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTDs）是一小段可以直接透過細(xì)胞膜的多肽，蛋白質(zhì)或多肽與PTDs相連后可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物功能。HIV-1反式激活蛋白TAT是目前研究較多的PTDs之一。TAT可將與其相連的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝、腎、心肌以及腦等器官組織。有研究證實(shí)，TAT與HO-1的融合蛋白（TAT-HO-1）可以成功轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入胰腺βTC-3細(xì)胞，并可顯著提高細(xì)胞活力。本研究前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)TAT-HO

3、-1可以轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入大鼠在體肝組織細(xì)胞，證實(shí)其可清除自由基，增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）活性，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，對TAT-HO-1在大鼠供肝冷保存期間是否能進(jìn)入肝組織細(xì)胞以及是否有效對供肝提供抗氧化和抗炎癥之保護(hù)作用，進(jìn)行進(jìn)一步探討。
　　 方法：對含有TAT-HO-1-pET32a質(zhì)粒的E.coli BL-21（DE3）菌株進(jìn)行培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)TAT-HO-1-pET32a表達(dá)、Ni-NTA-agar

4、ose純化，Western blot法對TAT-HO-1進(jìn)行定性分析，化學(xué)法檢測TAT-HO-1活性，證實(shí)所得蛋白為有活性的TAT-HO-1融合蛋白后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
　　 選擇雄性SD大鼠60只，體重250～300g。其中，12只用于TAT-HO-1轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入肝臟情況的研究。48只用于TAT-HO-1對冷保存肝臟保護(hù)作用的研究。根據(jù)所用保存液的不同按照隨機(jī)數(shù)字表分為兩組：C組，肝臟應(yīng)用4℃HTK液進(jìn)行灌注和冷保存；P組，肝臟應(yīng)用4

5、℃含TAT-HO-150μg/ml的HTK液進(jìn)行灌注和冷保存。參照Kamada等的方法切取肝臟。取下肝臟置于相應(yīng)保存液40ml中4℃保存。各組分別于冷保存0h、6h、12h和18h取材，抽取保存液及肝組織標(biāo)本立即置于-80℃冰箱保存。
　　 應(yīng)用免疫組化染色法檢測肝臟組織HO-1含量，分析TAT-HO-1轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入肝臟的情況。應(yīng)用Selectra-E全自動(dòng)生化分析儀（Vital，荷蘭）測定保存液中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（

6、ALT）和乳酸脫氫酶（LDH）含量。硫代巴比妥酸（TBA）法測定肝組織中MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。采用免疫組化法檢測腫瘤壞死因子（TNF-α）（試劑盒有武漢博士德生物試劑公司提供）。蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡和電鏡下觀察供肝組織形態(tài)學(xué)改變。
　　 結(jié)果：
　　 1、純化所得蛋白為TAT-HO-1蛋白，該蛋白可在冷保存期轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入大鼠肝臟。
　　 2、保存液中ALT、AST及LDH水平測定結(jié)果：

7、
　　 組內(nèi)比較：兩組保存液中ALT、AST及LDH濃度均隨著保存時(shí)間的延長而增高，上述指標(biāo)，兩兩時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組間比較：在冷保存0h時(shí)，兩組保存液中ALT、AST及LDH濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在6h、12h和18h保存時(shí)間點(diǎn)，蛋白組保存液中ALT、AST及LDH濃度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 3、組織中SOD活性、MDA和TNF-α含量測定

8、結(jié)果：
　　 組內(nèi)比較：兩組肝組織中MDA和TNF-α含量均隨保存時(shí)間延長而增高，這兩個(gè)指標(biāo)，兩兩時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；肝組織中SOD活性隨保存時(shí)間延長而降低，兩兩時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組間比較：在保存0h時(shí)，兩組肝組織中SOD活性、MDA和TNF-α含量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在6h、12h和18h時(shí)，蛋白組肝組織中MDA和TNF-α含量明顯低于HTK組，SOD活性

9、則明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 4、組織病理學(xué)觀察結(jié)果：
　　 光鏡下：在冷保存0h時(shí)兩組肝竇、肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞輕度腫脹，無細(xì)胞壞死。隨著冷保存時(shí)間的延長，肝竇、肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)逐漸消失，肝細(xì)胞腫脹加重、水樣變性明顯，多灶狀肝細(xì)胞壞死增多。在6h、12h和18 h時(shí)，蛋白組損傷程度輕于HTK組。
　　 電鏡下：隨著冷保存時(shí)間的延長，可見線粒體腫脹逐漸加重，嵴變短，數(shù)目