TAT-血紅素氧合酶-1融合蛋白對大鼠供肝冷保存期氧化和炎癥反應的影響.pdf

1、目的：原位肝移植現(xiàn)已廣泛用于終末期肝病治療，有研究報導術后1年60-65％發(fā)生免疫排斥反應。其主要原因之一是供肝冷保存期氧化和炎性損傷。目前由于供肝資源緊缺，如何有效保護供肝，減少移植肝臟的無功能的發(fā)生率更加受到了人們的重視。HO-1蛋白是機體血紅素分解代謝的限速酶，分解產生一氧化碳（CO）、膽綠素和Fe2+，具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡、下調血管內皮細胞細胞間黏附分子表達、減少血管損傷、增加移植器官的血流灌注等作用，引起國內外學者的廣泛

2、關注。蛋白轉導結構域（protein transduction domain，PTDs）是一小段可以直接透過細胞膜的多肽，蛋白質或多肽與PTDs相連后可進入細胞內發(fā)揮生物功能。HIV-1反式激活蛋白TAT是目前研究較多的PTDs之一。TAT可將與其相連的蛋白轉導入肝、腎、心肌以及腦等器官組織。有研究證實，TAT與HO-1的融合蛋白（TAT-HO-1）可以成功轉導進入胰腺βTC-3細胞，并可顯著提高細胞活力。本研究前期實驗證實TAT-HO

3、-1可以轉導進入大鼠在體肝組織細胞，證實其可清除自由基，增強超氧化物歧化酶（SOD）活性，減輕脂質過氧化反應。本研究在前期研究基礎上，對TAT-HO-1在大鼠供肝冷保存期間是否能進入肝組織細胞以及是否有效對供肝提供抗氧化和抗炎癥之保護作用，進行進一步探討。
　　 方法：對含有TAT-HO-1-pET32a質粒的E.coli BL-21（DE3）菌株進行培養(yǎng)，用IPTG誘導TAT-HO-1-pET32a表達、Ni-NTA-agar

4、ose純化，Western blot法對TAT-HO-1進行定性分析，化學法檢測TAT-HO-1活性，證實所得蛋白為有活性的TAT-HO-1融合蛋白后進行動物實驗。
　　 選擇雄性SD大鼠60只，體重250～300g。其中，12只用于TAT-HO-1轉導進入肝臟情況的研究。48只用于TAT-HO-1對冷保存肝臟保護作用的研究。根據所用保存液的不同按照隨機數(shù)字表分為兩組：C組，肝臟應用4℃HTK液進行灌注和冷保存；P組，肝臟應用4

5、℃含TAT-HO-150μg/ml的HTK液進行灌注和冷保存。參照Kamada等的方法切取肝臟。取下肝臟置于相應保存液40ml中4℃保存。各組分別于冷保存0h、6h、12h和18h取材，抽取保存液及肝組織標本立即置于-80℃冰箱保存。
　　 應用免疫組化染色法檢測肝臟組織HO-1含量，分析TAT-HO-1轉導進入肝臟的情況。應用Selectra-E全自動生化分析儀（Vital，荷蘭）測定保存液中谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（

6、ALT）和乳酸脫氫酶（LDH）含量。硫代巴比妥酸（TBA）法測定肝組織中MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。采用免疫組化法檢測腫瘤壞死因子（TNF-α）（試劑盒有武漢博士德生物試劑公司提供）。蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡和電鏡下觀察供肝組織形態(tài)學改變。
　　 結果：
　　 1、純化所得蛋白為TAT-HO-1蛋白，該蛋白可在冷保存期轉導進入大鼠肝臟。
　　 2、保存液中ALT、AST及LDH水平測定結果：

7、
　　 組內比較：兩組保存液中ALT、AST及LDH濃度均隨著保存時間的延長而增高，上述指標，兩兩時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。組間比較：在冷保存0h時，兩組保存液中ALT、AST及LDH濃度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在6h、12h和18h保存時間點，蛋白組保存液中ALT、AST及LDH濃度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 3、組織中SOD活性、MDA和TNF-α含量測定

8、結果：
　　 組內比較：兩組肝組織中MDA和TNF-α含量均隨保存時間延長而增高，這兩個指標，兩兩時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；肝組織中SOD活性隨保存時間延長而降低，兩兩時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。組間比較：在保存0h時，兩組肝組織中SOD活性、MDA和TNF-α含量，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在6h、12h和18h時，蛋白組肝組織中MDA和TNF-α含量明顯低于HTK組，SOD活性

9、則明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 4、組織病理學觀察結果：
　　 光鏡下：在冷保存0h時兩組肝竇、肝細胞索結構清晰，肝細胞輪廓清晰，細胞輕度腫脹，無細胞壞死。隨著冷保存時間的延長，肝竇、肝細胞索結構逐漸消失，肝細胞腫脹加重、水樣變性明顯，多灶狀肝細胞壞死增多。在6h、12h和18 h時，蛋白組損傷程度輕于HTK組。
　　 電鏡下：隨著冷保存時間的延長，可見線粒體腫脹逐漸加重，嵴變短，數(shù)目