視網(wǎng)膜新生血管化相關(guān)因子基因多態(tài)性與ROP的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、背景:
　　 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(Retinopathy of prematurity，ROP)是一種發(fā)生于小胎齡、低體重的早產(chǎn)嬰兒中的血管增殖性視網(wǎng)膜病變，在世界范圍內(nèi)，ROP是導(dǎo)致兒童視力損失和失明的主要病因。隨著新生兒監(jiān)護技術(shù)的提高，極低與超低出生體重兒的存活率不斷上升，導(dǎo)致ROP的高危人群也不斷擴大。所以盡管ROP的診療技術(shù)取得了很大進展，但該癥仍然是早產(chǎn)兒視力損害和致盲的最主要原因。在出生體重低于1250克的早產(chǎn)兒中RO

2、P有50％的發(fā)病率，其中，10％發(fā)展為3期病變。視網(wǎng)膜脫離一般發(fā)生于3期病變以上的重癥患者，大部分為退行性病變。ROP的主要病理特征是視網(wǎng)膜新生血管化，血管的異常增生引起視網(wǎng)膜脫離、黃斑皺褶、近視、弱視、斜視，最終可能導(dǎo)致視力損失和失明。ROP的病因未完全明了，多種因素增加ROP的危險性，尤其是早產(chǎn)、低出生體重和氧氣治療與ROP的發(fā)病相關(guān)。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，ROP在白人中的患病率明顯高于黑人，男性的發(fā)病率高于女性。更發(fā)現(xiàn)在給予嚴(yán)格及時

3、的干預(yù)治療后，有的患兒ROP可以自行消退，有的卻不斷發(fā)展。提示遺傳背景不同可能造成這些差別，基因差異不僅與ROP發(fā)病的風(fēng)險有關(guān)，而且會影響ROP的程度。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)是最常見的基因變異，包括血管內(nèi)皮生長因子在內(nèi)多種血管調(diào)節(jié)因子與視網(wǎng)膜新生血管化有密切關(guān)系，評價視網(wǎng)膜新生血管化相關(guān)因子的基因多態(tài)性對ROP發(fā)病的影響將有助于高風(fēng)險人群的早期鑒別與及時干預(yù)。近年來，來自發(fā)達

4、國家的學(xué)者已經(jīng)對多個血管調(diào)節(jié)因子基因多態(tài)性與ROP的關(guān)聯(lián)性展開了多項研究，為遺傳因素對ROP發(fā)病的影響提供了警示。然而，這些研究往往局限于單個候選基因的個別位點，缺乏對多基因、多位點的聯(lián)合研究，使結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性;并且由于研究方法不同和目標(biāo)人群的種族差異，導(dǎo)致很多結(jié)果互相矛盾，缺乏肯定性的結(jié)論。而國內(nèi)該領(lǐng)域的研究更是幾乎空白。
　　 目的:
　　 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)是常見的兒童致盲性疾病，視網(wǎng)膜新生血管化異常是RO

5、P的主要病理特征。本研究擬在中國漢族人群中，采取候選基因策略、病例對照研究的方法，應(yīng)用質(zhì)譜分析等SNP分型技術(shù)，聯(lián)合分析多基因的多個SNP位點對不同程度ROP發(fā)病的影響。以驗證視網(wǎng)膜新生血管化相關(guān)因子基因多態(tài)性與ROP的關(guān)聯(lián)性，識別和評價遺傳因素對ROP發(fā)生發(fā)展的作用。結(jié)果對ROP的防治與管理有重要指導(dǎo)意義，并為探討ROP的發(fā)病機制、易感基因的篩查及未來的基因治療奠定理論與實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1采取病例-對照

6、研究，研究對象為2011年1月至2012年12月期間，在深圳市婦幼保健院新生兒科住院的早產(chǎn)兒。由同一眼科醫(yī)師通過雙目間接檢眼鏡或廣角數(shù)碼視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)（RetcamⅡ）進行ROP篩查，ROP的篩查、診斷、分期標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2004年中華醫(yī)學(xué)會制定的《早產(chǎn)兒治療用氧和視網(wǎng)膜病變防治指南》。在完成篩查的早產(chǎn)兒中，選擇胎齡＜32周或出生體重＜1500g的早產(chǎn)兒。其中，隨機選擇90例篩查正常的早產(chǎn)兒為對照組，根據(jù)ROP病變嚴(yán)重程度將ROP割兒分別選入

7、重癥組和輕癥組，重癥組73例,輕癥組78例，3組共241例。重癥組包括閾值前1型ROP、閾值ROP、4、5期ROP及急進性后部型ROP(AP-ROP)，患兒需要接受激光光凝或玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)治療;輕癥組包括1、2期ROP、未達到閾值病變標(biāo)準(zhǔn)的3期ROP及以上各期瘢痕期ROP，患兒不需要進行手術(shù)治療。均排除家族性滲出性視網(wǎng)膜病變家族史、其他眼底病變者、Norrie's disease、糖尿病、嚴(yán)重心臟病、呼吸性疾病、肝腎功能異常及其他全身

8、血管異常性疾病。所有患兒均為漢族，無血緣關(guān)系。本項研究獲得受試者家長簽名的書面知情同意書和我院倫理委員會的批準(zhǔn)。
　　 2參考國外文獻，選擇7種視網(wǎng)膜新生血管化相關(guān)因子的基因作為候選基因，檢測其中14個SNP位點的多態(tài)性。
　　 3所有受檢者各取外周靜脈血0.5ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，保存在-80℃冰箱。采用血液基因組抽提試劑盒提取DNA。根據(jù)引物設(shè)計原則，采用Primer Premier5.0軟件自行

9、設(shè)計引物序列，PCR儀擴增后得到目標(biāo)PCR片段備用。
　　 4分別采用MassARRAY時間飛行質(zhì)譜系統(tǒng)、PCR凝膠電泳法、直接測序法對相關(guān)基因位點進行單核苷酸多態(tài)性檢測。
　　 5本研究采用獨立樣本t檢驗比較胎齡、出生體重的組間差異;采用卡方檢驗比較性別的組間差異;采用卡方檢驗分析組間各SNP位點基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡，以判定樣本的群體代表性;采用卡方檢驗比較各位點基因型頻率及基因頻率的組間差異

10、;對于多個樣本率的多重比較采用Bonferroni法對檢驗水準(zhǔn)進行校正，即將原來設(shè)定的檢驗水準(zhǔn)除以檢驗次數(shù)，得到實際用于確定統(tǒng)計學(xué)意義的檢驗水準(zhǔn);校正胎齡、出生體重等相關(guān)風(fēng)險因素，采用雙變量Logistic回歸分析法對卡方檢驗中有顯著性意義的SNP位點基因型與ROP做多因素關(guān)聯(lián)分析，比較各位點基因型對不同程度ROP發(fā)病的影響，計算比值比(Odds ratio，OR)和95％可信區(qū)間(confidence interval，CI)。檢驗水

11、準(zhǔn)α=0.05，即P＜0.05說明具有統(tǒng)計學(xué)差異，所有資料均經(jīng)過Microsoft Excel軟件錄入，應(yīng)用SPSS13.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1一般資料比較
　　 SNP位點基因分型成功230例，成功率為95.4％。其中，對照組90例成功分型85例，重癥組73例成功分型71例，輕癥組78例成功分型74例。共有11人剔除出研究，對分型成功的230例早產(chǎn)兒相關(guān)資料進行分析。
　　

12、 采用卡方檢驗對輕癥組、重癥組、對照組三組間的性別進行比較。各組間性摘要別分布無顯著差異，x2=0.7478，P=0.787，＞0.05;采用獨立樣本t檢驗分別對輕癥組與對照組、重癥組與對照組、重癥組與輕癥組之間的胎齡與體重吸氧時間、機械通氣時間等進行比較，重癥組嬰兒胎齡、出生體重、吸氧時間、機械通氣時問均明顯低于對照組與輕癥組;輕癥組嬰兒胎齡與出生體重亦明顯低于對照組，差別均有顯著意義，P＜0.05。
　　 2遺傳平衡檢驗經(jīng)

13、Hardy-weinberg定律吻合度檢測，達到遺傳平衡，Hardy-Weinberg平衡檢驗:三組中各等位基因頻率分布均服從Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P＞0.05)，說明群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體，證實抽樣和分型結(jié)果可靠。樣本具有群體遺傳代表性。
　　 3各基因SNP位點基因型及等位基因頻率的組間比較
　　 3.1 VEGF基因SNP位點基因型及等位基因頻率的組間比較
　　 VEG

14、F基因+405、+936基因型頻率在三組間有顯著性差異(分別為P=0.000，P=0.010，＜0.05);而VEGF基因-460、-2578基因型頻率在三組間無顯著性差異（分別為P=0.87，P=0.98，＜0.05）。其中，VEGF基因+405基因型頻率分布在重癥組與對照組、重癥組與輕癥組之間有顯著差異（兩組均為P=0.000，＜0.017），而在輕癥組與對照組間基因型頻率分布無顯著性差異(P=0.873，＞0.017);VEGF基

15、因+936基因型頻率分布在重癥組與對照組之間有顯著差異(P=0.010，＜0.017)，而在輕癥組與對照組、重癥組與輕癥組間無顯著性差異(分別為P=0.552，P=0.055，＞0.017)。
　　 VEGF基因+405、+936等位基因頻率在三組間有顯著性差異(分別為P=0.000，P=0.002，＜0.05);而-460、-2578等位基因頻率在三組間無顯著性差異（分別為P=0.990，P=0.429，＜0.05）。其中，V

16、EGF基因+405等位基因頻率在重癥組與對照組比較、重癥組與輕癥組比較，有顯著性差異(分別為P=0.000，P=0.015，＜0.017)，重癥組與對照組間，相對于G等位基因，攜帶C等位基因發(fā)生重癥ROP的風(fēng)險度為2.711(OR:2.711，95％CI:1.709-4.302);重癥組與輕癥組間，相對于G等位基因，攜帶C等位基因者發(fā)生重癥ROP風(fēng)險度為1.798(OR:1.798,95％CI:1.121-2.885)。VEGF基因+9

17、36等位基因頻率在重癥組與對照組比較有顯著性差異(P=0.001，＜0.017)，相對于C等位基因，攜帶T等位基因發(fā)生重癥ROP的風(fēng)險度為2.684(OR:2.684，95％CI:1.521-4.739)。
　　 3.2 PEDF基因各SNP位點基因型及等位基因頻率的組間比較
　　 PEDF基因-5376基因型頻率分布在三組問有顯著性差異(P=0.003，＜0.05)。其中，重癥組與對照組之間有顯著差異(P=0.000，

18、＜0.017);而輕癥組與對照組、重癥組與輕癥組間基因型頻率分布無顯著性差異(分別為P=0.472，P=0.24，＞0.017)。而+311基因型頻率在各組之間的分布無顯著差異(P=0.182，＞0.05)。
　　 PEDF基因-5376等位基因頻率在三組間有顯著性差異(P=0.003，＜0.05)，而+311等位基因頻率組間無顯著差異(P=0.383，＞0.05)。其中，PEDF基因-5376等位基因頻率在重癥組與對照組比較、

19、重癥組與輕癥組比較有顯著性差異（分別為P=0.001，P=0.009，＜0.017），而輕癥組與對照組無顯著性差異(P=0.531，＞0.017)。重癥組與對照組間，相對于C等位基因，攜帶T等位基因發(fā)生重癥ROP的風(fēng)險度為2.213(OR:2.213，95％CI:1.371-3.572);重癥組與輕癥組間，相對于C等位基因，攜帶T等位基因發(fā)生重癥ROP的風(fēng)險度為1.919(OR:1.919，95％CI:1.170-2.883.1485)

20、。
　　 3.3 eNOS基因SNP位點基因型及等位頻率的組間比較
　　 eNOS基因-786、+894基因型頻率在三組之間無顯著性差異(分別為P=0.590，P=0.834，＞0.05);eNOS基因-786與+894等位基因頻率在三組之間無顯著差異（分別為P=0.231，P=0.410，＞0.05）。
　　 3.4 IGF-1R基因SNP位點基因型及等位基因頻率的組間比較
　　 IGF-1R基因+31

21、74基因型、等位基因頻率在三組之間未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（分別為P=0.25，P=0.661，＞0.05）。
　　 3.5 Ang-2基因SNP位點基因型及等位基因頻率的組間比較
　　 Ang-2基因+35基因型、等位基因分布頻率在三組之間未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（分別為P=0.951，P=0.892，＞0.05）。
　　 3.6 ACE基因型及等位基因頻率的組間比較
　　 ACE基因I/D基因型、等位基因在三組之間分

22、布頻率未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（分別為P=0.777，P=0.773，＞0.05）。
　　 3.7 ND基因SNP位點基因型及等位基因頻率的組間比較
　　 采用質(zhì)譜檢測法對ND基因Val60Glu、Ala105Thr位點多態(tài)性進行檢測，DNA直接測序法對+597C/A多態(tài)性進行檢測，未發(fā)現(xiàn)上述位點的基因多態(tài)性。其中Val60Glu等位基因全部為T，Ala105Thr等位基因全部為G，+597等位基因全部為C。
　　 3.

23、8相關(guān)SNP與ROP關(guān)聯(lián)性的logistic分析
　　 采用二分類Logistic回歸分析相關(guān)SNP與ROP關(guān)聯(lián)性。校正胎齡和出生體重后，在重癥組與對照組間，VEGF基因+405G/C、+936C/T多態(tài)性及PEDF基因-5376C/T基因多態(tài)性與重癥ROP顯著相關(guān)(分別為P=0.010; P=0.023; P=0.045，＜0.05)。其中，VEGF基因+405 GG基因型與CC基因型相比，患重癥ROP的風(fēng)險度為0.140(O

24、R:0.140，95％CI:0.039-0.505)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003;＜0.05);VEGF基因+936CT基因型與CC基因型相比，患重癥ROP的風(fēng)險度為3.281(OR:3.281，95％CI:1.272-8.462)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014;＜0.05); PEDF基因-5376CT基因型與TT基因型相比，患重癥ROP的風(fēng)險度為0.315(OR:0.315，95％CI:0.121-0.817)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=

25、0.018;＜0.05)。在輕癥組與重癥組間，VEGF基因+405G/C基因多態(tài)性與重癥ROP顯著相關(guān)(P=0.000，＜0.05)。其中，GG、GC基因型與CC基因型相比，患重癥ROP的風(fēng)險度分別為0.088(OR:0.088，95％CI:0.028-0.279)和0.276(OR:0.27，95％CI:0.110-0.693)，有統(tǒng)計學(xué)意義（分別為P=0.000; P=0.006;＜0.05）。此外，在重癥組與對照組、重癥組與輕癥組

26、間，VEGF基因-460TT/+405CC單倍型組合均顯著增加了患重癥ROP的風(fēng)險(OR:5.319,95％CI:2.034-13.904, P=0.001)和(OR:3.878,95％CI:1.693-8.885,P=0.001);相反，在重癥組與對照組、重癥組與輕癥組間，-460TT/+405GG單倍型組合均顯著降低了患重癥ROP的風(fēng)險(OR:0.121，95％CI:0.022-0.660，P=0.015)和(OR:0.289,95

27、％CI:0.123-0.680, P=0.019)。
　　 結(jié)論:本次實驗中共研究了7種視網(wǎng)膜新生血管化相關(guān)因子的基因，對其中的14個SNP位點進行分型檢測，發(fā)現(xiàn)VEGF基因+405G/C、+936C/T多態(tài)性及PEDF基因-5376C/T多態(tài)性與重癥ROP顯著相關(guān)，與輕癥ROP沒有相關(guān)性。VEGF基因+405CC、+936CT基因型及PEDF基因-5376TT基因型可能是重癥ROP的易感基因型;VEGF基因+405C、+936

28、T等位基因及PEDF基因-5376T等位基因可能是重癥ROP的風(fēng)險等位基因;VEGF基因-460TT/+405CC單倍型組合可能是重癥ROP的風(fēng)險單倍型組合。推測相關(guān)基因多態(tài)性在基因轉(zhuǎn)錄水平上影響了血管因子的正常表達。研究中同時發(fā)現(xiàn)VEGF基因+405基因型和等位基因頻率及PEDF基因-5376等位基因頻率在重癥組與輕癥組之間也存在顯著差異，提示輕癥與重癥ROP之間存在不同的遺傳背景，基因變異可能在重癥ROP的發(fā)病中起重要作用，而輕癥R