SARS冠狀病毒檢測寡核苷酸基因芯片的研制及應用.pdf

1、該研究首先確立了長鏈寡核苷酸基因芯片實驗的基本條件,通過采用幾種不同的基質材料進行點樣雜交,以獲得最適合長鏈寡核苷酸點樣的片基材料以及最適的點樣濃度和特異性.進而確定了用于寡核苷酸芯片雜交檢測所需要的最佳探針片段長度.然后根據NCBI網站GENEBANK數據庫中SARS-CoV的序列信息,采用生物信息學方法設計了長度為60mer的寡核苷酸作為探針,并對其進行BLAST比對,采用了嚴格的遴選標準,從中選出特異性高的30條作為探針,點樣制備

2、SARS冠狀病毒60mer寡核苷酸檢測基因芯片,采用vero E6細胞培養(yǎng)的SARS-CoV作為陽性對照樣品,采用HepG2細胞總RNA作為陰性對照樣品進行對比研究.通過采用限制性熒光標記技術進行全基因組擴增標記,標記產物純化后與芯片進行雜交,采用激光共聚焦掃描儀進行掃描,Array-ProAnalyzer軟件采集圖像并進行圖像分析,分別對陽性、陰性對照的樣品雜交結果進行分析,進而對探針進行了篩選和最終的確定.為解決臨床樣品病毒含量低,

3、以及可能存在的樣品污染等問題,該研究對限制性熒光標記技術進行了改進.通過在擴增體系中加入熒光標記的dNTP對樣品同時進行兩種熒光標記,提高了單位分子標記片段的熒光強度值,并增加了檢測的靈敏度.同時,在樣品標記過程中還引入了防污染措施,可防止陽性擴增產物污染可能造成的假陽性結果的出現.通過上述過程制備Oligo芯片用于中試規(guī)模的臨床檢測,由廣東省疾病預防控制中心采集601例臨床樣品(200例臨床確診患者咽漱液樣品,401例臨床排除患者以及