AAV-HGFK1和Adv-p53聯(lián)合轉(zhuǎn)基因治療小鼠大腸癌的綜合研究.pdf

1、研究目的: 發(fā)達(dá)國家和地區(qū)中大腸癌發(fā)病率是腫瘤中的第二位，臨床上大腸癌肝轉(zhuǎn)移療效不佳，5年生存率不足10％，60％的大腸癌患者致死原因?yàn)楦无D(zhuǎn)移?？寡苌莎煼ㄊ桥R床上新的有效治療方法，如：表皮生長因子受體(EGFR)的單克隆抗體cetuximab，panitumumab和nimotuzomab。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)抗體bevacizumab(商品名Avastin)被美國FDA批準(zhǔn)為晚期結(jié)直腸癌的一線治療藥物。基因治療

2、是新型有希望的腫瘤治療方案。 研究抗血管生成基因治療是治療中晚期實(shí)體瘤的需要。據(jù)報(bào)道人肝細(xì)胞生長因子第1螺旋區(qū)(HGFK1)具有抗血管生成作用，腺病毒體外和體內(nèi)都增強(qiáng)rAAV的轉(zhuǎn)染，我們發(fā)現(xiàn)rAAV-HGFK1對大鼠肝癌原位模型具有顯著療效，對EGFR磷酸化具有顯著的抑制作用。 本課題為了深入研究其抗血管生成的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)rAAV-HGFK1和Ad-p53對EGFR和HGFR的作用，驗(yàn)證Ad-p53是否能增強(qiáng)rAAV-HG

3、FK1療效，評(píng)價(jià)和比較了3種基因治療方案： (1)rAAV-HGFK1， (2)Ad-p53， (3)rAAV-HGFK1+Ad-p53對大腸癌動(dòng)物模型的療效，遠(yuǎn)期目標(biāo)是開發(fā)出新的抗血管生成基因治療方案。 方法: 體外選擇人源的Lovo大腸癌細(xì)胞、小鼠的CT26大腸癌細(xì)胞和SV40大T抗原(tsA-58-3)轉(zhuǎn)化的小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞MILESVEN1(MS1)、SV40轉(zhuǎn)化的能成瘤的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞株S

4、VEC4-10EE2(SV10)內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，提取此4種細(xì)胞株總RNAs，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR半定量測定EGFR、HGFR基因轉(zhuǎn)錄水平。 體內(nèi)試驗(yàn)選擇人大腸癌細(xì)胞Lovo和小鼠大腸癌細(xì)胞株CT26，通過手術(shù)每只裸鼠或小鼠分別注射1×106個(gè)Lovo或5×105個(gè)CT26細(xì)胞到脾被膜下，制備肝轉(zhuǎn)移小鼠模型，每組3只小鼠通過小鼠尾靜脈注射rAAV-HGFK1，分為三個(gè)劑量， (1)分別為(1)Ad-p53:2.5×

5、109vp/只， (2)低劑量rAAV-HGFK1+Ad-p53：5.0×1010vg+2.5×109vp/只， (3)高劑量rAAV-HGFK1+Ad-p53:1.5×1011vg+2.5×109vp/只，試驗(yàn)rAAV-HGFK1劑量療效關(guān)系，然后，選擇高劑量rAAV進(jìn)行每組6只小鼠的四組基因治療生存時(shí)間試驗(yàn)，四組分別為 (A)rAAV-EGFP、 (B)rAAV-HGFK1、 (C)rAAV-

6、EGFP+Ad-p53、 (D)rAAV-HGFK1+Ad-p53，再用以上CT26大腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型每組5只，做此四組基因治療，接種細(xì)胞后12天和20天進(jìn)行療效觀察，稱每只小鼠辟和肝重量，并留取脾、肝和胰標(biāo)本石蠟切片，HE染色觀察腫瘤細(xì)胞壞死情況，用抗CD31、抗vWF的抗體免疫組化染色，先在低倍光鏡下(40倍)確定腫瘤內(nèi)新生血管最密集區(qū)，在高倍視野(200倍)計(jì)數(shù)5個(gè)視野新生血管數(shù)進(jìn)行比較，用抗HGFK1、抗EGFP抗體免

7、疫組化染色測定AAV感染情況和目的基因表達(dá)情況，用TUNEL染色檢測凋亡細(xì)胞，每組每張切片隨機(jī)取5個(gè)200×高倍鏡視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)(200個(gè))，凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比即凋亡率。 結(jié)果: MTT法檢測細(xì)胞增殖率發(fā)現(xiàn)，104vg/細(xì)胞rAAV-HGFK1和103vp／細(xì)胞Ad-p53感染后，2％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，CT26和Lovo細(xì)胞增殖無顯著差異，2ng/ml和20ng／ml的HGF對CT26細(xì)胞和MS1

8、細(xì)胞增殖無顯著影響。但是，rAAV-HGFK1顯著抑制了無血清培養(yǎng)液中HGF對Lovo和SV10的刺激增殖作用，也顯著抑制了0.2％血清培養(yǎng)液中4ng/ml和40ng/ml的EGF對SV10和MS1細(xì)胞的刺激作用，同樣顯著抑制了0.2％血清培養(yǎng)液中2ng/ml和20ng/ml的HGF刺激SV10細(xì)胞增殖的作用。 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，rAAV-EGFP和Adv感染組在20小時(shí)后，絕大部分劃痕區(qū)被細(xì)胞覆蓋，而在rAAV-EGFP+Ad

9、-p53或rAAV-HGFK1+Ad-EGFP感染組，較少的細(xì)胞進(jìn)入劃痕區(qū)。Ad-p53和rAAV-HGFK1感染組最少的細(xì)胞進(jìn)入劃痕區(qū)，表明rAAV-HGFK1或Ad-p53對SV10和MS1細(xì)胞的遷移都有抑制作用，Ad-p53增強(qiáng)了rAAV-HGFK1的這種抑制作用。 rAAV-HGFK1零劑量、低劑量和高劑量組治療CT26大腸癌轉(zhuǎn)移的BALB／c小鼠的平均生存期為23、36.7和53天，治療Lovo大腸癌轉(zhuǎn)移的裸鼠平均生存

10、期為34、38.6,和47天。結(jié)果提示使用高劑量rAAV-HGFK1聯(lián)合Ad-p53治療大腸癌轉(zhuǎn)移模型有較好的療效。 生存試驗(yàn)中，rAAV-HGFK1聯(lián)合Ad-p53治療分別和兩者單藥治療組比較，在Lovo肝轉(zhuǎn)移和CT26肝轉(zhuǎn)移兩種模型中都顯著延長了小鼠的生存時(shí)間(P均<0.05，log-rank生存分析)。rAAV-HGFK1聯(lián)合Ad-p53治療組有一個(gè)BALB／c小鼠和兩個(gè)裸鼠仍然健康存活，人道處死小鼠后肉眼未發(fā)現(xiàn)體內(nèi)有腫瘤

11、。在各個(gè)治療組之間，細(xì)胞接種后12天時(shí)脾臟和肝臟的重量有顯著性差異，但rAAV-HGFK1和Ad-p53聯(lián)合治療組和兩者之一單藥治療組比較沒有顯著性差異，rAAV-HGFK1和Ad-p53聯(lián)合組中，4／6的小鼠在手術(shù)后12天肉眼未見有腫瘤，其余小鼠12天時(shí)都發(fā)現(xiàn)了肉眼可見的腫瘤。但20天時(shí)，聯(lián)合治療組脾臟和肝臟的腫瘤重量比其他各組包括兩個(gè)單藥治療組都顯著較輕(P<0.01)。 石蠟切片H&E染色觀察到rAAV-EGFP組脾細(xì)胞被

12、CT26細(xì)胞替代，CT26已經(jīng)侵襲肝臟大部分，聯(lián)合治療組肝臟腫瘤數(shù)目較少，腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)較明顯。用抗EGFP染色，因?yàn)镋GFP不能分泌到細(xì)胞外，棕色的陽性胰腺細(xì)胞和陰性胰腺細(xì)胞分界非常清楚，而且陽性細(xì)胞都是細(xì)胞漿陽性，細(xì)胞核無棕色染色。有意思的是rAAV-EGFP+Ad-p53組的陽性細(xì)胞數(shù)目明顯多于rAAV-EGFP組。肝切片用抗HGFK1抗體免疫組化染色，在rAAV-HGFK1組和rAAV-HGFK1+Ad-p53組中，rAAV攜帶

13、HGFK1在體內(nèi)都有效表達(dá)，由于病毒是通過尾靜脈注射入體內(nèi)，肝是此型rAAV的主要感染器官，所以肝內(nèi)大血管和小血管周圍的肝細(xì)胞在rAAV-HGFK1+Ad-p53組比rAAV-HGFK1組血管周圍陽性細(xì)胞數(shù)目多，很可能是Ad-p53在體內(nèi)增強(qiáng)了rAAV-HGFK轉(zhuǎn)染效率。因?yàn)閞AAV表達(dá)的HGFK1可以被分泌到細(xì)胞外，所以陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞之間界限不是很明顯。 石蠟切片用TUNEL染色，凋亡細(xì)胞染為棕色，rAAV-HGFK1+A

14、d-p53組中腫瘤占位區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)顯著多于rAAV-HGFK1組，在rAAV-EGFP對照組，腫瘤占位區(qū)中凋亡數(shù)目小于2％。 抗CD31組化染色顯示，對照組有大量新生血管，rAAV-EGFP+Ad-p53和rAAV-HGFK1治療組都有較多新生血管在腫瘤組織中生長，rAAV-HGFK1組比rAAV-EGFP組顯著減少，更重要的是rAAV-HGFK1+Ad-p53治療組新生血管數(shù)目比rAAV-HGFK1和rAAV-EGFP+Ad-

15、p53組顯著減少。為了排除HGFK1和p53基因表達(dá)下調(diào)CD31表達(dá)的可能性，我們用另一個(gè)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志vWF的抗體免疫組化染色，也得到類似的結(jié)果。 結(jié)論: rAAV-EGFP和Ad-null對大腸癌細(xì)胞Lovo和CT26的轉(zhuǎn)染有協(xié)同作用，Ad-null顯著增強(qiáng)了rAAV-EGFP對細(xì)胞的感染率。 rAAV-HGFK1顯著抑制了HGF和EGF對高表達(dá)EGFR和HGFR的Lovo和SV10的刺激增殖作用，顯著

16、抑制了EGFR和HGFR的磷酸化。 rAAV-HGFK1或Ad-p53對SV10和MS1細(xì)胞的遷移都有抑制作用，Ad-p53增強(qiáng)了rAAV-HGFK1的這種抑制作用。 rAAV-HGFK1或Ad-53單藥治療組均有一定的療效，兩者聯(lián)合治療組和rAAV-HGFK1或Ad-p53單藥治療組以及對照組小鼠比較，顯著延長了生存時(shí)間，Ad-p53增強(qiáng)了體內(nèi)rAAV-EGFP和rAAV-HGFK1表達(dá)。聯(lián)合治療組比單藥治療組顯著減慢