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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
miR-320a是多種常見(jiàn)惡性腫瘤的抑瘤 miRNA,其表達(dá)異常減少與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),但該 miRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況如何,其與膠質(zhì)瘤的良惡性級(jí)別及患者預(yù)后有何關(guān)系尚不清楚。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域包含蛋白1基因SND1及β-連環(huán)蛋白基因CTNNB1均是miR-320a的潛在靶基因,且其編碼蛋白的表達(dá)水平均隨膠質(zhì)瘤良惡性級(jí)別的升高而升高,但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中兩種基因是否是 miR-320a的
2、天然靶基因,兩種蛋白的表達(dá)水平與miR-320a的關(guān)系如何,尚需觀察與證實(shí)。此外,miR-320a對(duì)膠質(zhì)瘤的增殖和遷移侵襲有何影響,SND1和β-catenin在其中發(fā)揮了何種作用,其下游相關(guān)效應(yīng)通路如何亦需進(jìn)一步探討。本研究以不同級(jí)別人膠質(zhì)瘤標(biāo)本和人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象,對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。
方法:
1.采用組織微陣列和鎖定寡核苷酸探針原位雜交技術(shù),在120例不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及20例對(duì)照腦組
3、織中檢測(cè)miR-320a的陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)(LI%),分析不同級(jí)別膠質(zhì)瘤 miR-320a的表達(dá)變化,結(jié)合臨床隨訪資料,通過(guò) Kaplan-Meiers生存分析探討其表達(dá)水平與患者生存期之間的關(guān)系。采用莖環(huán) qRT-PCR檢測(cè)、比較永生化膠質(zhì)細(xì)胞系和7種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞系miR-320a的表達(dá)水平。
2.利用miR-320a mimics轉(zhuǎn)染人GBM細(xì)胞系U87MG及U251,利用莖環(huán)qRT-PCR驗(yàn)證瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率,采用
4、CCK8、體外克隆形成實(shí)驗(yàn)、transwell體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察外源性補(bǔ)充miR-320a對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。
3.采用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè) miR-320a的潛在靶點(diǎn),通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)在U87MG及U251中驗(yàn)證SND1和β-catenin的mRNA是否為miR-320a的靶mRNA。采用qRT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-320a后上述GBM細(xì)胞系SND1和β-cat
5、enin mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化,探索miR-320a敲低SND1和β-catenin表達(dá)的分子機(jī)制。
4.采用組織微陣列和免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)同批次膠質(zhì)瘤及對(duì)照腦組織標(biāo)本中Ki-67以及SND1和β-catenin的蛋白表達(dá)水平,分析各檢測(cè)指標(biāo)與膠質(zhì)瘤良惡性級(jí)別之間的關(guān)系以及其與miR-320a含量之間的相關(guān)性,尋找miR-320a調(diào)節(jié) SND1和β-catenin表達(dá)的組織學(xué)證據(jù)。結(jié)合臨床隨訪資料,通過(guò)Kaplan
6、-Meiers生存分析探討SND1和β-catenin表達(dá)水平與患者生存期之間的關(guān)系,并用單因素及多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型篩選膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。
5.利用CCK8實(shí)驗(yàn)、EDU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)miR-320a轉(zhuǎn)染對(duì) U87MG及 U251細(xì)胞系細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布的影響;在此基礎(chǔ)上,通過(guò)轉(zhuǎn)染SND1或β-catenin真核表達(dá)質(zhì)粒提高miR-320a轉(zhuǎn)染細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平,觀察其是否
7、可逆轉(zhuǎn)miR-320a對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布的影響。利用 Western blot檢測(cè)上述各組細(xì)胞 p21WAF1和 cyclin D1的表達(dá)水平,以明確miR-320a抑制GBM細(xì)胞增殖的效應(yīng)通路和分子機(jī)制。
6.利用transwell體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)觀察miR-320a轉(zhuǎn)染對(duì)GBM細(xì)胞系遷移和侵襲的影響以及補(bǔ)充外源性SND1或β-catenin是否能逆轉(zhuǎn)miR-320a對(duì)遷移侵襲的抑制作用。通過(guò)明膠酶譜分析和酪蛋白酶譜分
8、析檢測(cè)miR-320a轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP2和MMP7基質(zhì)金屬蛋白酶活性的變化,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-320a對(duì)細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP7 mRNA含量的影響。通過(guò)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-320a對(duì)GBM細(xì)胞系MMP2和MMP7蛋白表達(dá)的影響以及補(bǔ)充外源性SND1或β-catenin能否逆轉(zhuǎn)該影響,以明確miR-320a抑制GBM細(xì)胞遷移侵襲的效應(yīng)通路和分子機(jī)制。
7.利用重組慢病毒感染建立穩(wěn)定敲
9、低SND1的U87MG及U251亞細(xì)胞系及對(duì)照亞細(xì)胞系,通過(guò)transwell體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證SND1對(duì)GBM細(xì)胞遷移侵襲的影響。采用qRT-PCR檢測(cè)各亞細(xì)胞系總Smad2(T-Smad2)、Smad4以及MMP2 mRNA含量。利用Western blot檢測(cè)U87MG各亞細(xì)胞系總T-Smad2、P-Smad2、Smad4以及MMP2的蛋白水平以及外源性TGFβ1處理對(duì)其表達(dá)的影響,以探討SND1調(diào)節(jié)MMP2表達(dá)的分子機(jī)制
10、。
結(jié)果:
1.原位雜交結(jié)果顯示,各膠質(zhì)瘤組miR-320a表達(dá)含量均明顯低于非腫瘤對(duì)照腦組織,并隨腫瘤良惡性級(jí)別的升高而相應(yīng)降低,各膠質(zhì)組與對(duì)照組之間以及各級(jí)別膠質(zhì)瘤組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析顯示,在各級(jí)別組及所有120例膠質(zhì)瘤患者中高表達(dá)miR-320a患者的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(DFS)和總生存時(shí)間(OS)均明顯高于低表達(dá)miR-320a患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0
11、.0001)。莖環(huán) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,永生化膠質(zhì)細(xì)胞 UC2中 miR-320a水平明顯高于其它各膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01~0.001)。
2. CCK8實(shí)驗(yàn)和體外克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-320a轉(zhuǎn)染可明顯降低U87MG及U251細(xì)胞的增殖活性和U251細(xì)胞的克隆形成效率;Transwell體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-320a轉(zhuǎn)染可明顯降低兩種 GBM細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
12、3.生物信息學(xué)分析顯示,SND1和CTNNB1基因均為miR-320a的潛在靶基因。熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,含 miR-320a靶序列的野生型 SND1或β-catenin mRNA的3’UTR均可介導(dǎo) miR-320a對(duì)熒光素酶報(bào)告基因的沉默作用,而刪除miR-320a靶序列的突變型3’UTR不能介導(dǎo)上述沉默作用。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-320a轉(zhuǎn)染組SND1和β-catenin的mRNA及蛋白水平
13、均明顯低于無(wú)義對(duì)照序列轉(zhuǎn)染組,差異有顯著性(P<0.05~0.001)。以上結(jié)果證實(shí)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SND1和CTNNB1基因均為miR-320a的靶基因,miR-320a通過(guò)與SND1和β-catenin mRNA3’UTR上的靶序列結(jié)合誘導(dǎo)mRNA的降解并抑制其編碼蛋白的表達(dá)。
4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,各膠質(zhì)瘤組SND1、β-catenin及Ki-67 LI%均明顯高于非腫瘤對(duì)照腦組織,并均隨腫瘤的良惡性級(jí)別的升高而升
14、高,各膠質(zhì)瘤組與對(duì)照組間以及各級(jí)別膠質(zhì)瘤組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.001)。Pearson相關(guān)分析顯示,miR-320a LI%分別與Ki-67、SND1及β-catenin LI%呈顯著負(fù)相關(guān)性(Ki-67, r=-0.976;SND1, r=-0.981;β-catenin, r=-0.975),而Ki-67 LI%分別與SND1和β-catenin LI%呈顯著正相關(guān)性(SND1, r=0.984;β-catenin, r
15、=0.975)。生存分析證實(shí),在各級(jí)別組和所有120例膠質(zhì)瘤患者中,SND1及β-catenin高表達(dá)組的DFS和OS均明顯低于SND1及β-catenin低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。Cox回歸分析顯示,miR-320a LI%為膠質(zhì)瘤患者DFS和OS的保護(hù)性因素,而SND1和β-catenin LI%為其風(fēng)險(xiǎn)因素,其中miR-320a與SND1 LI%可作為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。
5. CCK8、
16、EdU檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-320a轉(zhuǎn)染可明顯降低U87MG及U251細(xì)胞的增殖活性,而通過(guò)真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染提高細(xì)胞內(nèi)SND1和β-catenin表達(dá)水平可有效逆轉(zhuǎn)miR-320a的增殖抑制作用。FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-320a轉(zhuǎn)染使 G0/G1期的細(xì)胞比例明顯高于無(wú)義對(duì)照序列轉(zhuǎn)染組;而提高 SND1和β-catenin表達(dá)水平則可逆轉(zhuǎn)miR-320a對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-320a可提高
17、GBM細(xì)胞內(nèi)p21WAF1的表達(dá)水平并降低cyclin D1的表達(dá)水平,且上述調(diào)控作用可分別被SND1和β-catenin真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實(shí)miR-320a可分別通過(guò)敲低SND1和β-catenin上調(diào)p21WAF1和下調(diào)cyclin D1的表達(dá),從而誘導(dǎo)GBM細(xì)胞的G1期阻滯。
6.體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-320a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯低于無(wú)義對(duì)照序列轉(zhuǎn)染組,而提高細(xì)胞內(nèi)SND1或β-cat
18、enin的表達(dá)水平可有效逆轉(zhuǎn) miR-320a對(duì)遷移侵襲的抑制作用。明膠和酪蛋白酶譜分析結(jié)果顯示, miR-320a轉(zhuǎn)染可降低U87MG與U251細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP2和MMP7的活性。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-320a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)MMP2和MMP7 mRNA含量顯著低于對(duì)照轉(zhuǎn)染組。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-320a轉(zhuǎn)染可下調(diào)GBM細(xì)胞MMP2和MMP7的表達(dá),而上述調(diào)節(jié)作用可分別被SND1和β-cateni
19、n真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實(shí), miR-320a可分別通過(guò)敲低 SND1和β-catenin抑制MMP2和MMP7的表達(dá),降低細(xì)胞的遷移侵襲能力。
7. Transwell體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)敲低SND1可有效抑制GBM細(xì)胞系的遷移侵襲能力。qRT-PCR與Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,在穩(wěn)定敲低SND1的GBM亞細(xì)胞系,其Smad2、Smad4和MMP2 mRNA表達(dá)水平以及T-Smad2、P-Smad
20、2、Smad4和 MMP2蛋白水平均明顯低于對(duì)照亞細(xì)胞系,證實(shí)在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中敲低 SND1可抑制 TGFβ通路關(guān)鍵因子和 MMP2的表達(dá)。經(jīng)外源性TGFβ1刺激后,對(duì)照亞細(xì)胞系T-Smad2、P-Smad2、Smad4和MMP2蛋白水平均有明顯提高,而穩(wěn)定敲低SND1的GBM亞細(xì)胞系除P-Smad2及MMP2的含量略有上升外,其余蛋白含量無(wú)明顯改變,證實(shí)敲低 SND1可降低 GBM細(xì)胞TGFβ通路的活性及其對(duì)外源性TGFβ的反應(yīng)性,消
21、弱其誘導(dǎo)MMP2表達(dá)的能力。
結(jié)論:
1.人膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中普遍存在miR-320a表達(dá)異常降低, miR-320a表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤良惡性級(jí)別升高而相應(yīng)降低,可作為輔助膠質(zhì)瘤良惡性分級(jí)的參考指標(biāo)。
2. miR-320a可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,其表達(dá)異常降低是GBM細(xì)胞快速增殖和活躍遷移侵襲的重要機(jī)制,在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
3.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SND1和β-ca
22、tenin mRNA均是miR-320a的靶mRNA, miR-320a可以其種子序列與SND1和β-catenin mRNA3’UTR上的靶序列結(jié)合,誘導(dǎo)二者降解,并在轉(zhuǎn)錄后水平抑制SND1和β-catenin蛋白的表達(dá)。
4.在人膠質(zhì)瘤組織中,SND1和β-catenin表達(dá)水平亦隨膠質(zhì)瘤良惡性程度的升高而增加,其表達(dá)水平與miR-320a呈顯著負(fù)相關(guān),說(shuō)明膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-320a表達(dá)減少是SND1和β-catenin
23、過(guò)表達(dá)的重要原因。三者的表達(dá)水平均與患者的DFS和OS相關(guān),其中miR-320a和SND1 LI%是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。
5. miR-320a通過(guò)敲低SND1上調(diào)p21WAF1的表達(dá)水平,通過(guò)敲低β-catenin下調(diào)cyclin D1的表達(dá)水平,從而阻遏GBM細(xì)胞G1/S期過(guò)渡、誘導(dǎo)細(xì)胞的G1期阻滯、抑制細(xì)胞的增殖。
6. miR-320a分別通過(guò)敲低SND1和β-catenin抑制MMP2和MMP7的
24、表達(dá),從而起到抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的作用。
7.敲低SND1可抑制TGFβ通路關(guān)鍵因子的表達(dá),降低GBM細(xì)胞TGFβ通路的活性及其對(duì)外源性TGFβ刺激的反應(yīng)性,消弱其上調(diào)MMP2表達(dá)的能力,這可能是miR-320a通過(guò)敲低SND1抑制MMP2表達(dá)的重要機(jī)制。
8. miR-320a是膠質(zhì)瘤的多功能抑瘤因子,其可通過(guò)多靶點(diǎn)多通路抑制膠質(zhì)瘤的增殖和遷移侵襲。上述研究成果為探索膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了重要線索,為惡
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