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1、目的:利用臨床收集的150例左右膠質(zhì)瘤標(biāo)本,利用cDNA芯片和Affymetrix Oligo芯片對(duì)不同樣本在不同平臺(tái)進(jìn)行膠質(zhì)瘤特異性靶標(biāo)篩選和分析,并對(duì)兩組芯片篩選出的12重要基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)驗(yàn)證,通過上述分析找到有進(jìn)一步深入研究?jī)r(jià)值的診斷靶標(biāo)和治療靶點(diǎn)。同時(shí)采用Meta分析對(duì)兩種芯片找到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析,較好解決不同平臺(tái)、不同芯片、不同樣本,導(dǎo)致芯片分析的數(shù)據(jù)重復(fù)性和可靠性差的問題。最后,總結(jié)了應(yīng)用基因芯
2、片對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行研究的方法。 方法: 1、cDNA芯片腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)分析該部分應(yīng)用cDNA芯片技術(shù)建立38張膠質(zhì)瘤基因表達(dá)譜,其中星形質(zhì)瘤細(xì)胞瘤Ⅰ級(jí)1例;Ⅱ級(jí)7例;Ⅲ級(jí)5例;Ⅳ級(jí)20例,少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅱ級(jí)4例;Ⅲ級(jí)1例。結(jié)合膠質(zhì)瘤臨床流行病學(xué)特點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩選在所有膠質(zhì)瘤實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組一致上調(diào)或下調(diào)的差異表達(dá)基因;篩選星形膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤之間差異基因;篩選和增殖、凋亡和分化相關(guān)的基因;并關(guān)注目前
3、研究中與膠質(zhì)瘤發(fā)病和惡性變相關(guān)的熱點(diǎn)基因或生物學(xué)指標(biāo)的變化;針對(duì)篩選出的重點(diǎn)差異表達(dá)基因,對(duì)其生物學(xué)功能結(jié)合當(dāng)前數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)報(bào)道,以整體和網(wǎng)絡(luò)的思想闡明其間相互作用關(guān)系,進(jìn)而探討膠質(zhì)瘤發(fā)病和惡變的機(jī)制。 2、Affymetrix Oligo芯片腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)分析本部分使用Affymetrix Human U133 2.0基因表達(dá)譜芯片,該芯片含54000個(gè)探針集,45000個(gè)轉(zhuǎn)錄本、38500個(gè)已知功能基因?qū)π切钨|(zhì)瘤細(xì)胞瘤Ⅰ級(jí)2例
4、;Ⅱ級(jí)5例;Ⅲ級(jí)5例;Ⅳ級(jí)5例,少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅱ級(jí)5例;室管膜瘤Ⅱ級(jí)4例共26例膠質(zhì)瘤進(jìn)行表達(dá)譜分析。應(yīng)用生物信息學(xué)及相應(yīng)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Gene Ontology和GO分析;利用挖掘出的基因數(shù)據(jù)利用支持向量機(jī)法和貝葉斯混合協(xié)變量分析法對(duì)高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤進(jìn)行判別檢驗(yàn);挖掘出的基因數(shù)據(jù)利用最近鄰域分析法和最近質(zhì)心法對(duì)三種不同類型膠質(zhì)瘤進(jìn)行判別檢驗(yàn);并用貝葉斯學(xué)習(xí)構(gòu)建基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。 3、對(duì)兩組芯片篩選出的12條重要基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光
5、定量PCR(RT-PCR)驗(yàn)證4、對(duì)cDNA芯片和Oligo芯片腦膠質(zhì)瘤表達(dá)譜數(shù)據(jù)Meta分析并總結(jié)應(yīng)用基因芯片對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行研究的方法 結(jié)果: 1、篩選出的差異基因: (1)按不同標(biāo)準(zhǔn)篩選出不同類型膠質(zhì)瘤及不同級(jí)別膠質(zhì)瘤之間差異基因①、13例星形膠質(zhì)瘤(A)、20例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(G)、5例少枝膠質(zhì)瘤(O)之間以p(0.1為標(biāo)準(zhǔn)篩選出111條差異基因,功能涉及細(xì)胞周期、有絲分裂、細(xì)胞免疫等重要功能; ②、低
6、級(jí)別星膠(AⅠ+AⅡ)9例與高級(jí)別星膠(AⅢ+GBM)之間以p(0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選出409條差異基因; ③、A與G之間p<0.005為標(biāo)準(zhǔn)篩選出145條差異基因; ④、A與O之間p<0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選出391條差異基因; ⑤、G與O之間p<0.005為標(biāo)準(zhǔn)篩選出452條差異基因,用以上差異基因進(jìn)行非監(jiān)督聚類,均能理想?yún)^(qū)分不同腫瘤,證實(shí)不同級(jí)別及類型膠質(zhì)瘤間存在基因上的不同; (2)對(duì)AⅡ7例、AⅢ5例、G
7、BM 20例進(jìn)行差異基因篩選: ①、AⅡ與AⅢ以p<0.01篩選出78條差異基因; ②、AⅢ與GBM以p<0.005篩選出66條差異基因;低級(jí)別星膠(AⅠ+AⅡ)9例與高級(jí)別星膠(AⅢ+GBM)之間以p<0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選出409條差異基因; ③、AⅡ與GBM以p<0.001篩選出121條差異基因,聚類結(jié)果理想。 2、依據(jù)cDNA膠質(zhì)瘤表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立判別方程,對(duì)膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)和判斷。
8、 膠質(zhì)瘤在顯微鏡下病理診斷存在主觀誤差,鑒于膠質(zhì)瘤基因表達(dá)譜的樣本聚類結(jié)果提示其病理分類有分子生物學(xué)基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)依據(jù)cDNA膠質(zhì)瘤表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法嘗試建立判別方程,可以對(duì)膠質(zhì)瘤樣本較好的預(yù)測(cè)和判斷。 3、研究中所發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的基因、重要染色體以及在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用通路在所有38例樣本中,其中至少在27例(70%)膠質(zhì)瘤中都有差異表達(dá)的基因677條。其中一致下調(diào)的基因有453個(gè),一致上調(diào)的基因有22
9、4個(gè)。其中屬于intracellularcomponent、binding和metabolism組分的較多,其功能主要包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、及細(xì)胞分化等。對(duì)與膠質(zhì)瘤相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了染色體定位研究,發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的染色體變化多涉及1p,17p,13q,9p,19,10,22q,18q,和7,12q,和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。在調(diào)控通路方面進(jìn)行生物信息分析,發(fā)現(xiàn)如下通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用:cell cycle;cell dif
10、ferentiate-on;apotosis;immune respone;DNA repair;cell proliferation。在對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)重點(diǎn)基因分析中發(fā)現(xiàn)有10條重要上調(diào)基因值得深入研究。 4、星形膠質(zhì)瘤中腫瘤標(biāo)志物研究對(duì)33張星形膠質(zhì)瘤芯片進(jìn)行重點(diǎn)分析,目的找到能做為鑒別星形膠質(zhì)瘤及不同惡性程度的腫瘤標(biāo)志物,按在1/3星膠中及1.5倍表達(dá)差異為標(biāo)準(zhǔn),T檢驗(yàn)、FDR雙重統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選出星形膠質(zhì)瘤Ⅰ、Ⅱ級(jí)與Ⅲ
11、、Ⅳ級(jí)間分型基因148條,上調(diào)34條,下調(diào)114條;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)與Ⅳ級(jí)星膠分型基因110條,上調(diào)28條,下調(diào)82條。為找到理想診斷靶和治療靶做進(jìn)一步深入研究,特別關(guān)注以下幾條隨星形膠質(zhì)瘤級(jí)別增加而表達(dá)增加的上調(diào)基因。 ① COL1A2; ② MAP3K7; ③ SGCE; ④ RB1; ⑤ CCL4; ⑥ SPP1; ⑦ ID3; ⑧ MTHFD1: ⑨ NPC2;
12、 ⑩ GMEB1。 5、星形膠質(zhì)瘤Ⅱ級(jí)、少枝膠質(zhì)瘤Ⅱ級(jí)、室管膜瘤Ⅱ級(jí)三種同一級(jí)別不同類型膠質(zhì)瘤的分子標(biāo)志物研究。 所分析出的這些基因可較準(zhǔn)確地區(qū)分和預(yù)測(cè)以上三類腫瘤。支持向量機(jī)法和貝葉斯混合協(xié)變量分析法能較好對(duì)高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤進(jìn)行判別檢驗(yàn),準(zhǔn)確率在85%以上;挖掘出的基因數(shù)據(jù)利用最近鄰域分析法和最近質(zhì)心法對(duì)三種不同類型膠質(zhì)瘤進(jìn)行判別檢驗(yàn)的準(zhǔn)確率不到70%;并用貝葉斯學(xué)習(xí)構(gòu)建基因相互作用網(wǎng)絡(luò),能較好說明10條重要基
13、因相互之間作用關(guān)系。 6、VEGF、SOD2、COL1A2、MAP3K7、CDC2、SPP16條基因經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證,與星形膠質(zhì)瘤病理級(jí)別呈正向依賴關(guān)系。 結(jié)論: 1、基因芯片技術(shù)在后基因組時(shí)代在膠質(zhì)瘤研究中仍發(fā)揮重要作用; 2、不同平臺(tái)、不同芯片、不同樣本,芯片分析的數(shù)據(jù)不盡相同,而Meta分析能較好解決芯片數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性差的問題; 3、生物信息學(xué)能很好對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘和分析;
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