cDNA芯片和Oligo芯片在人腦膠質(zhì)瘤特異性靶標(biāo)研究中的應(yīng)用.pdf

1、目的：利用臨床收集的150例左右膠質(zhì)瘤標(biāo)本，利用cDNA芯片和Affymetrix Oligo芯片對不同樣本在不同平臺進(jìn)行膠質(zhì)瘤特異性靶標(biāo)篩選和分析，并對兩組芯片篩選出的12重要基因進(jìn)行實時熒光定量PCR(RT-PCR)驗證，通過上述分析找到有進(jìn)一步深入研究價值的診斷靶標(biāo)和治療靶點。同時采用Meta分析對兩種芯片找到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，較好解決不同平臺、不同芯片、不同樣本，導(dǎo)致芯片分析的數(shù)據(jù)重復(fù)性和可靠性差的問題。最后，總結(jié)了應(yīng)用基因芯

2、片對膠質(zhì)瘤進(jìn)行研究的方法。 方法： 1、cDNA芯片腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)分析該部分應(yīng)用cDNA芯片技術(shù)建立38張膠質(zhì)瘤基因表達(dá)譜，其中星形質(zhì)瘤細(xì)胞瘤Ⅰ級1例；Ⅱ級7例；Ⅲ級5例；Ⅳ級20例，少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅱ級4例；Ⅲ級1例。結(jié)合膠質(zhì)瘤臨床流行病學(xué)特點對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選在所有膠質(zhì)瘤實驗組和對照組一致上調(diào)或下調(diào)的差異表達(dá)基因；篩選星形膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤之間差異基因；篩選和增殖、凋亡和分化相關(guān)的基因；并關(guān)注目前

3、研究中與膠質(zhì)瘤發(fā)病和惡性變相關(guān)的熱點基因或生物學(xué)指標(biāo)的變化；針對篩選出的重點差異表達(dá)基因，對其生物學(xué)功能結(jié)合當(dāng)前數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)報道，以整體和網(wǎng)絡(luò)的思想闡明其間相互作用關(guān)系，進(jìn)而探討膠質(zhì)瘤發(fā)病和惡變的機(jī)制。 2、Affymetrix Oligo芯片腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)分析本部分使用Affymetrix Human U133 2.0基因表達(dá)譜芯片，該芯片含54000個探針集，45000個轉(zhuǎn)錄本、38500個已知功能基因?qū)π切钨|(zhì)瘤細(xì)胞瘤Ⅰ級2例

4、；Ⅱ級5例；Ⅲ級5例；Ⅳ級5例，少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅱ級5例；室管膜瘤Ⅱ級4例共26例膠質(zhì)瘤進(jìn)行表達(dá)譜分析。應(yīng)用生物信息學(xué)及相應(yīng)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Gene Ontology和GO分析；利用挖掘出的基因數(shù)據(jù)利用支持向量機(jī)法和貝葉斯混合協(xié)變量分析法對高、低級別膠質(zhì)瘤進(jìn)行判別檢驗；挖掘出的基因數(shù)據(jù)利用最近鄰域分析法和最近質(zhì)心法對三種不同類型膠質(zhì)瘤進(jìn)行判別檢驗；并用貝葉斯學(xué)習(xí)構(gòu)建基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。 3、對兩組芯片篩選出的12條重要基因進(jìn)行實時熒光

5、定量PCR(RT-PCR)驗證4、對cDNA芯片和Oligo芯片腦膠質(zhì)瘤表達(dá)譜數(shù)據(jù)Meta分析并總結(jié)應(yīng)用基因芯片對膠質(zhì)瘤進(jìn)行研究的方法 結(jié)果： 1、篩選出的差異基因： (1)按不同標(biāo)準(zhǔn)篩選出不同類型膠質(zhì)瘤及不同級別膠質(zhì)瘤之間差異基因①、13例星形膠質(zhì)瘤(A)、20例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(G)、5例少枝膠質(zhì)瘤(O)之間以p(0.1為標(biāo)準(zhǔn)篩選出111條差異基因，功能涉及細(xì)胞周期、有絲分裂、細(xì)胞免疫等重要功能； ②、低

6、級別星膠(AⅠ+AⅡ)9例與高級別星膠(AⅢ+GBM)之間以p(0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選出409條差異基因； ③、A與G之間p<0.005為標(biāo)準(zhǔn)篩選出145條差異基因； ④、A與O之間p<0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選出391條差異基因； ⑤、G與O之間p<0.005為標(biāo)準(zhǔn)篩選出452條差異基因，用以上差異基因進(jìn)行非監(jiān)督聚類，均能理想?yún)^(qū)分不同腫瘤，證實不同級別及類型膠質(zhì)瘤間存在基因上的不同； (2)對AⅡ7例、AⅢ5例、G

7、BM 20例進(jìn)行差異基因篩選： ①、AⅡ與AⅢ以p<0.01篩選出78條差異基因； ②、AⅢ與GBM以p<0.005篩選出66條差異基因；低級別星膠(AⅠ+AⅡ)9例與高級別星膠(AⅢ+GBM)之間以p<0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選出409條差異基因； ③、AⅡ與GBM以p<0.001篩選出121條差異基因，聚類結(jié)果理想。 2、依據(jù)cDNA膠質(zhì)瘤表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法建立判別方程，對膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行預(yù)測和判斷。

8、 膠質(zhì)瘤在顯微鏡下病理診斷存在主觀誤差，鑒于膠質(zhì)瘤基因表達(dá)譜的樣本聚類結(jié)果提示其病理分類有分子生物學(xué)基礎(chǔ)，本實驗依據(jù)cDNA膠質(zhì)瘤表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法嘗試建立判別方程，可以對膠質(zhì)瘤樣本較好的預(yù)測和判斷。 3、研究中所發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的基因、重要染色體以及在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用通路在所有38例樣本中，其中至少在27例(70％)膠質(zhì)瘤中都有差異表達(dá)的基因677條。其中一致下調(diào)的基因有453個，一致上調(diào)的基因有22

9、4個。其中屬于intracellularcomponent、binding和metabolism組分的較多，其功能主要包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、及細(xì)胞分化等。對與膠質(zhì)瘤相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了染色體定位研究，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的染色體變化多涉及1p，17p,13q,9p，19,10,22q,18q,和7,12q，和相關(guān)文獻(xiàn)報道一致。在調(diào)控通路方面進(jìn)行生物信息分析，發(fā)現(xiàn)如下通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用：cell cycle；cell dif

10、ferentiate-on；apotosis；immune respone；DNA repair；cell proliferation。在對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)重點基因分析中發(fā)現(xiàn)有10條重要上調(diào)基因值得深入研究。 4、星形膠質(zhì)瘤中腫瘤標(biāo)志物研究對33張星形膠質(zhì)瘤芯片進(jìn)行重點分析，目的找到能做為鑒別星形膠質(zhì)瘤及不同惡性程度的腫瘤標(biāo)志物，按在1/3星膠中及1.5倍表達(dá)差異為標(biāo)準(zhǔn)，T檢驗、FDR雙重統(tǒng)計學(xué)方法篩選出星形膠質(zhì)瘤Ⅰ、Ⅱ級與Ⅲ

11、、Ⅳ級間分型基因148條，上調(diào)34條，下調(diào)114條；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級與Ⅳ級星膠分型基因110條，上調(diào)28條，下調(diào)82條。為找到理想診斷靶和治療靶做進(jìn)一步深入研究，特別關(guān)注以下幾條隨星形膠質(zhì)瘤級別增加而表達(dá)增加的上調(diào)基因。 ① COL1A2； ② MAP3K7； ③ SGCE； ④ RB1； ⑤ CCL4； ⑥ SPP1； ⑦ ID3； ⑧ MTHFD1： ⑨ NPC2；

12、 ⑩ GMEB1。 5、星形膠質(zhì)瘤Ⅱ級、少枝膠質(zhì)瘤Ⅱ級、室管膜瘤Ⅱ級三種同一級別不同類型膠質(zhì)瘤的分子標(biāo)志物研究。 所分析出的這些基因可較準(zhǔn)確地區(qū)分和預(yù)測以上三類腫瘤。支持向量機(jī)法和貝葉斯混合協(xié)變量分析法能較好對高、低級別膠質(zhì)瘤進(jìn)行判別檢驗，準(zhǔn)確率在85％以上；挖掘出的基因數(shù)據(jù)利用最近鄰域分析法和最近質(zhì)心法對三種不同類型膠質(zhì)瘤進(jìn)行判別檢驗的準(zhǔn)確率不到70％；并用貝葉斯學(xué)習(xí)構(gòu)建基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，能較好說明10條重要基

13、因相互之間作用關(guān)系。 6、VEGF、SOD2、COL1A2、MAP3K7、CDC2、SPP16條基因經(jīng)RT-PCR驗證，與星形膠質(zhì)瘤病理級別呈正向依賴關(guān)系。 結(jié)論： 1、基因芯片技術(shù)在后基因組時代在膠質(zhì)瘤研究中仍發(fā)揮重要作用； 2、不同平臺、不同芯片、不同樣本，芯片分析的數(shù)據(jù)不盡相同，而Meta分析能較好解決芯片數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性差的問題； 3、生物信息學(xué)能很好對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘和分析；