以細胞增殖抑制基因p27為靶點治療低氧性肺動脈高壓的實驗研究.pdf

1、在低氧性肺動脈高壓(hypoxicpulmonaryhypertension,HPH)發(fā)生發(fā)展過程中，低氧性肺血管收縮(hypoxicpulmonaryvasoconstriction,HPV)和肺血管重建是其兩個主要病理生理學特征。肺血管重建是肺動脈高壓持續(xù)存在且難以治療的關(guān)鍵原因，肺動脈中膜平滑肌細胞的異常增生為肺血管壁重建的一個主要病理表現(xiàn)。隨著對HPH發(fā)生機理的研究深入，抑制或逆轉(zhuǎn)肺血管重建已成為防治HPH及其并發(fā)癥的主要目標，

2、但目前尚缺乏特異性治療措施。我們實驗室之前的研究顯示丹參酮IIA磺酸鈉(sodiumtanshinoneIIAsulphonate,STS)可抑制低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞(pulmonaryarterialsmoothmusclecell,PASMC)增殖，防止肺小動脈重塑，但其機制仍未闡明。
　　細胞增殖與細胞增殖周期有關(guān)，細胞增殖周期受細胞周期蛋白(cyclin)及其依賴蛋白激酶(cyclin-dependentkinase

3、,CDK)和CDK抑制物(cyclin-dependentkinaseinhibitor,CDKI)的共同調(diào)控。p27是抑制細胞增殖的重要因子之一。目前已有研究結(jié)果顯示HPH時p27是肺動脈平滑肌細胞中唯一表達量顯著減少的CDKI，上調(diào)p27可抑制PASMC增殖。因此，增加p27的表達將有利于抑制肺血管結(jié)構(gòu)重建,防治肺動脈壓過度增高，改善HPH病人的預后。S期蛋白相關(guān)激酶2(Sphasekinaseassociatedprotein2,

4、Skp2)是p27的降解過程的一個重要調(diào)控分子，可被磷酸化的Akt(p-Akt)激活進而參與p27的降解調(diào)節(jié)。
　　本實驗通過觀察STS在整體和細胞水平抑制肺血管平滑肌細胞增殖的作用及其對p27影響，探討STS治療HPH的可能機制。并進一步采用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了HS-p27-pAcGFP1-1重組質(zhì)粒，通過sm22啟動子和低氧反應元件(hypoxiaresponseelement,HRE)增強子的共同作用使外源性p27靶向定位于

5、處于低氧條件下的血管平滑肌細胞內(nèi)，從而條件性調(diào)控p27的表達，實現(xiàn)特異性、靶向性、有效抑制低氧性PASMC增殖作用，達到防治HPH的目的，有望為HPH的防治提供新的策略和手段。
　　一、STS上調(diào)p27的表達防治大鼠HPH的發(fā)生
　　1、實驗目的
　　從整體和細胞兩個水平觀察STS抑制低氧誘導的肺小動脈重塑及PASMC增殖的作用及其對p27、Skp2及p-Akt的影響，探討STS預防HPH發(fā)生和抑制低氧性PASMC增殖

6、作用的可能機制。
　　2、實驗方法
　　將大鼠或原代培養(yǎng)的大鼠PASMC分為四個組：常氧組(N)，常氧給藥組(N+STS)，低氧組(H)，低氧給藥組(H+STS)。利用低壓低氧艙復制大鼠的HPH模型；導管法檢測血流動力學指標；計算右心肥厚指數(shù)；肺組織切片HE染色檢測肺小動脈的形態(tài)學變化；MTT法檢測細胞增殖情況；流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化；RT-PCR檢測肺組織和培養(yǎng)細胞中p27、Skp2的表達；Western-blot檢測

7、p27、Skp2和p-Akt的表達。
　　3、實驗結(jié)果
　?。?）動物實驗結(jié)果：低氧性肺動脈高壓模型復制成功，STS可以明顯減輕低氧引起的肺動脈高壓和肺小動脈壁重塑。低氧使大鼠肺組織內(nèi)p27的蛋白表達水平降低，但不影響p27mRNA的表達，低氧可激活Akt信號轉(zhuǎn)導通路，使p-Akt表達明顯增加，誘導Skp2在mRNA和蛋白表達水平升高；STS可以降低低氧引起的p-Akt表達的增多，抑制低氧誘導的Skp2mRNA和蛋白表達的升

8、高，逆轉(zhuǎn)低氧對p27蛋白表達的下調(diào)作用。
　　（2）細胞實驗結(jié)果：低氧刺激PASMC增殖，誘導細胞由G0/G1期向G2/S期的轉(zhuǎn)化，激活Akt信號通路，p-Akt表達增加，誘導Skp2mRNA和蛋白表達增加，p27蛋白表達降低；STS可以抑制低氧引起的PASMC的增殖，減少低氧誘導的細胞周期轉(zhuǎn)化，抑制低氧引起的Skp2和p-Akt升高及p27蛋白表達的減少。
　　4、實驗結(jié)論
　　低氧通過Akt-Skp2-p27通路促

9、進PASMC增殖，STS則可以阻斷該通路抑制低氧引起的PASMC增殖。
　　二、HRE增強的sm22啟動子驅(qū)動p27靶向性抑制低氧引起的PASMC增殖的研究
　　1、實驗目的
　　構(gòu)建HS-p27-pAcGFP1-1重組質(zhì)粒，條件性調(diào)控p27的表達，特異性、靶向性有效性的抑制低氧性PASMC增殖。
　　2、實驗方法
　　應用PCR、酶切、連接等技術(shù)構(gòu)建p27-pcDNA3.1、sm22-pAcGFP1-1、

10、HRE-sm22-pAcGFP1-1、sm22-p27-pAcGFP1-1、HS-p27-pAcGFP1-1五種重組質(zhì)粒。
　　在不同種類的細胞轉(zhuǎn)染sm22-pAcGFP1-1檢測sm22啟動子特異性；在PASMC轉(zhuǎn)染HRE-sm22-pAcGFP1-1后給予常氧和低氧刺激檢測HRE對低氧的反應性；MTT法檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化，Western-blot檢測p27、Skp2的表達。
　　3、實驗結(jié)果

11、　?。?）成功構(gòu)建了五種重組質(zhì)粒。
　?。?）轉(zhuǎn)染p27-pcDNA3.1后PASMC細胞增殖被顯著抑制。
　　（3）轉(zhuǎn)染sm22-pAcGFP1-1質(zhì)粒后48h，綠色熒光蛋白GFP在血管平滑肌細胞A10、PASMC中有表達，而在293、3T3、A549等非平滑肌細胞內(nèi)未見表達。
　?。?）轉(zhuǎn)染HRE-sm22-pAcGFP1-1質(zhì)粒后48h低氧組PASMC中的熒光強度明顯強于常氧組。
　?。?）PASMC在轉(zhuǎn)染