皮膚老化過程中角質(zhì)形成細(xì)胞比較蛋白質(zhì)組分析與鑒定.pdf

1、目的：皮膚老化的機(jī)制不明，且臨床實(shí)際中缺乏皮膚老化判斷的客觀指標(biāo)。本課題以青年、中年、老年人曝光部位及非曝光部位的皮膚為研究對(duì)象，探尋其中差異表達(dá)的蛋白或特異表達(dá)的蛋白有可能成為皮膚老化的標(biāo)志性蛋白，探討角質(zhì)形成細(xì)胞在皮膚老化過程中的作用及分子機(jī)制。為后續(xù)研究全面解釋皮膚老化的機(jī)制，揭示衰老的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：借助蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)平臺(tái)，采用DispaseⅡ分離出表皮，優(yōu)化改進(jìn)樣本處理方法，使用加入了cocktail，RN

2、ase和DNase的裂解液提取表皮組織總蛋白，經(jīng)等電聚焦和垂直電泳，銀染后獲得了表皮組織中角質(zhì)形成細(xì)胞2-DE圖像，建立和優(yōu)化了適合于表皮組織研究的雙向凝膠電泳方法。染色后的凝膠用GS800密度掃描儀掃描，并用PDQuest7.4圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，強(qiáng)度校正、背景消減、點(diǎn)檢測(cè)、匹配、ID校正，確定差異蛋白點(diǎn)。挑選其中的蛋白點(diǎn)進(jìn)一步行MALDI-TOF質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫查詢，最后鑒定差異候選蛋白。
　　結(jié)果：獲得的雙向凝膠電泳圖

3、譜較為清晰，蛋白質(zhì)點(diǎn)分離完全，各組重復(fù)3次后得到的圖譜非常相似，進(jìn)行3塊膠間的蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配，測(cè)量膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)在第一向IEF方向的偏差為(1.798±1.232)mm，在第二向SDS-PAGE方向上的偏差為(1.063±1.031)mm，獲得了重復(fù)性較好匹配率高的表皮組織雙向凝膠電泳圖譜，由此成功建立了適合人表皮組織比較蛋白質(zhì)組研究的雙向凝膠電泳方法。
　　角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白在pH3～10的范圍均有分布，但主要集中分布在pH5～8范

4、圍內(nèi)，相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在19～110kD之間。在pH5～8范圍內(nèi)蛋白點(diǎn)的檢測(cè)、量化和點(diǎn)的匹配結(jié)果顯示：
　　青年組曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞的平均蛋白點(diǎn)數(shù)為387±21,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)81.6％。中年組曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞平均蛋白點(diǎn)數(shù)為380±31,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)83.7％。分析比較兩組2-DE圖譜共確定43個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中12個(gè)蛋白點(diǎn)在青年組曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，17個(gè)蛋白點(diǎn)在中年組曝光部位2-D

5、E圖譜中高表達(dá)，14個(gè)蛋白點(diǎn)在兩者間有2倍以上顯著性量變。
　　中年組曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞的平均蛋白點(diǎn)數(shù)為380±31,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)83.7％。老年組曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞平均蛋白點(diǎn)數(shù)為365±17,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)84.5％。分析比較兩組2-DE圖譜共確定38個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中13個(gè)蛋白點(diǎn)在中年組曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，5個(gè)蛋白點(diǎn)在老年組曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，20個(gè)蛋白點(diǎn)在兩者間有2倍以上顯著

6、性量變。
　　青年組非曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞的平均蛋白點(diǎn)數(shù)為372±18,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)82.2％。中年組非曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞平均蛋白點(diǎn)數(shù)為363±19,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)85.8％。分析比較兩組2-DE圖譜共確定47個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中16個(gè)蛋白點(diǎn)在青年組非曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，9個(gè)蛋白點(diǎn)在中年組非曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，22個(gè)蛋白點(diǎn)在兩者間有2倍以上顯著性量變。
　　中年組非曝光部位角質(zhì)形

7、成細(xì)胞平均蛋白點(diǎn)數(shù)為363±19,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)85.8％。老年組非曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞的平均蛋白點(diǎn)數(shù)為359±15,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)83.4％。分析比較兩組2-DE圖譜共確定40個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中11個(gè)蛋白點(diǎn)在中年組非曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，8個(gè)蛋白點(diǎn)在老年組非曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，21個(gè)蛋白點(diǎn)在兩者間有2倍以上顯著性量變。
　　青年組曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞的平均蛋白點(diǎn)數(shù)為387±21,3塊膠間

8、蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)81．6％。青年組非曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞平均蛋白點(diǎn)數(shù)為372±18,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)82.2％。分析比較兩組2-DE圖譜共確定48個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中17個(gè)蛋白點(diǎn)在青年組曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，11個(gè)蛋白點(diǎn)在青年組非曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，20個(gè)蛋白點(diǎn)在兩者間有2倍以上顯著性量變。
　　中年組曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞的平均蛋白點(diǎn)數(shù)為380±31,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)83.7％。中年組非曝光部

9、位角質(zhì)形成細(xì)胞平均蛋白點(diǎn)數(shù)為363±19,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)85.8％。分析比較兩組2-DE圖譜共確定43個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中12個(gè)蛋白點(diǎn)在中年組曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，13個(gè)蛋白點(diǎn)在中年組非曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，18個(gè)蛋白點(diǎn)在兩者間有2倍以上顯著性量變。
　　老年組曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞的平均蛋白點(diǎn)數(shù)為365±17,3塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)84.5％。老年組非曝光部位角質(zhì)形成細(xì)胞平均蛋白點(diǎn)數(shù)為359±15，3

10、塊膠間蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配率達(dá)83.4％。分析比較兩組2-DE圖譜共確定37個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中9個(gè)蛋白點(diǎn)在老年組曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，14個(gè)蛋白點(diǎn)在老年組非曝光部位2-DE圖譜中高表達(dá)，14個(gè)蛋白點(diǎn)在兩者間有2倍以上顯著性量變。
　　選取其中的35個(gè)差異蛋白進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫查詢，成功鑒定了21個(gè)與皮膚老化相關(guān)的候選蛋白。我們的實(shí)驗(yàn)獲得了一些有價(jià)值的發(fā)現(xiàn)：在不同的年齡組、不同的部位檢測(cè)到了相同的蛋白，3次檢測(cè)

11、到膜聯(lián)蛋白A2(annexinA2)、2次檢測(cè)到角蛋白K2C80、2次檢測(cè)到熱休克蛋白、2次檢測(cè)到谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、2次檢測(cè)到白蛋白（albumin），提示這幾種蛋白可能為皮膚老化中的重要蛋白質(zhì)；通過組間的比較分析，在青年組和中年組曝光部位HSP高表達(dá)，在青年組和老年組曝光部位K2C80高表達(dá)，提示HSP和K2C80可能是光老化的特異蛋白；在青年組和中年組的非暴光部位都有膜聯(lián)蛋白A2(annexinA2)及谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移

12、酶(GSTs)的表達(dá)，在中年組和老年組的非暴光部位都有白蛋白（albumin）的表達(dá)，可能與自然老化密切相關(guān)；而P21可能與自然老化直接相關(guān)，HSP70與紫外線導(dǎo)致的皮膚光老化關(guān)系密切。
　　結(jié)論：利用蛋白質(zhì)組的技術(shù)平臺(tái)，建立了適合皮膚老化研究的比較蛋白質(zhì)組的方法。通過比較不同部位、不同年齡人群中皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞在自然、連續(xù)、動(dòng)態(tài)的成長過程中存在差異表達(dá)蛋白。鑒定的21個(gè)候選蛋白功能各異，它們通過參與細(xì)胞的基礎(chǔ)能量代謝；影響蛋白質(zhì)

13、的合成、折疊、降解過程；調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化；參與細(xì)胞骨架蛋白的構(gòu)建；參與細(xì)胞的凋亡、免疫調(diào)控。使細(xì)胞增殖能力降低，加速細(xì)胞的凋亡；損傷細(xì)胞之間的連接，分泌各種細(xì)胞因子，通過各種通路，加速膠原的降解，導(dǎo)致氧化和抗氧化的失衡，形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，在自然老化和（或）光老化的過程發(fā)揮一定作用。
　　我們探尋到其中差異表達(dá)的蛋白或特異表達(dá)的蛋白有可能成為皮膚老化的標(biāo)志性蛋白，初步探討了角質(zhì)形成細(xì)胞在皮膚老化過程中的作用及分子機(jī)