靶向白血病干細胞的抗CD3-IL3及其二硫鍵穩(wěn)定構型的融合蛋白的構建、表達及活性研究.pdf

1、背景與目的：白血病的發(fā)生、治療中耐藥乃至白血病復發(fā)的根本原因在于患者體內存在著一群白血病干細胞(LSC)。它跟正常的干細胞一樣具有自我更新和分化潛能。它在全血細胞中僅占0.25—1.0％。傳統(tǒng)的白血病治療通常是細胞毒藥物的聯(lián)合化療配合造血干細胞移植,然而這種方法選擇性差,在殺傷腫瘤細胞的同時也損害體內某些類型的正常細胞,而且只能殺死大部分已分化的腫瘤細胞不能殺死腫瘤干細胞,因此造成腫瘤治療效果的不理想。所以,只有靶向腫瘤干細胞的治療才能

2、使惡性腫瘤治愈。在白血病干細胞表面具有一些不同于正常干細胞的表面標志。針對這些表面標志的靶向治療將有效地靶向腫瘤干細胞而對正常干細胞沒有任何損傷。研究發(fā)現(xiàn)CD123是AML干細胞所特有的表面標志,其在正常造血干細胞(CD34+,CD38-)的表達<1％,而在急性髓系白血病干細胞的的表達>99％。除此之外,CD123在其他白血病細胞的表面也有表達。
　　 人白細胞介素3(IL-3)是CD123的配體,是造血干細胞增殖分化的正性調節(jié)

3、因子,可刺激多能干細胞和多種祖細胞的增殖與分化。IL-3還可增強白血病細胞對某些化療藥物敏感性,能選擇性地誘導白血病細胞進人細胞周期,使周期特異性化療藥物對急性粒細胞白血病(AML)細胞的毒性增強。此外IL-3還可與IL4協(xié)同作用,促進T淋巴細胞前體細胞的發(fā)育,誘導CD4+T淋巴細胞自分泌生長,IL3可直接或間接地影響細胞毒T淋巴細胞的成熟和增殖。
　　 基于外周血淋巴細胞(Peripheral blood lymphocyte

4、,PBL)的生物治療已經(jīng)成為重要的抗腫瘤策略之一。PBL中的T細胞可以通過與腫瘤細胞接觸形成T細胞-腫瘤細胞突觸樣結構,直接對腫瘤細胞發(fā)揮細胞殺傷作用。然而,T細胞識別過程的復雜給腫瘤細胞提供了很多機會來逃逸T細胞對其特異性識別,因此腫瘤細胞得以存活并增殖。CD3是T淋巴細胞表面特異分子,通過它可以募集具有殺傷作用的T淋巴細胞。
　　 本實驗基于此構建了抗CD3抗體的Fv與IL3融合形成的抗CD3-IL3融合蛋白,并且通過改造獲

5、得了表達量高、穩(wěn)定性好的抗CD3-m2IL3,抗CD3-⊿IL3融合蛋白。為增強抗CD3-m2IL3,抗CD3-⊿IL3融合蛋白的穩(wěn)定性,在VL間VH引入了人二硫鍵,表達并純化后測定它們體外生物學活性和介導效應細胞殺傷靶細胞的作用。
　　 方法：用重疊PCR(Overlap PCR)和PCR方法,構建抗CD3/IL3表達載體pAYZCD3/IL3,再用PCR法通過引物在抗CD3VL-100位和抗CD3VH-44位引入半胱氨酸突變

6、,構建二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/IL3表達載體pAYZCD3*/IL3,轉化感受態(tài)大腸桿菌16C9進行原核表達。表達產(chǎn)物經(jīng)6×His-tag親和層析柱分離純化,12％SDS—PAGE電泳及westen-blot鑒定。用同樣的方法表達抗CD3*/m2IL3、抗CD3/m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白。應用間接免疫熒光和競爭性免疫熒光結合流式細胞分析技術(FACS)檢測抗CD3*/m2IL3、抗CD3/m2IL3,抗

7、CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白與CD123+M07e細胞和CD3+Jurkat細胞的結合活性,將4種融合蛋白在0.2％的人血清白蛋白中37℃溫育不同時間點至72h后,通過間接免疫熒光法FACS檢測其結合活性,并比較二者的穩(wěn)定性。
　　 利用非放射性熒光染料Calcein-AM進行抗體介導的體外特異性殺傷活性檢測,Ficoll-Hypaque法分離外周血淋巴細胞(PBL)作為效應細胞,首先以TF1細胞或M07e或A

8、ML病人干細胞(CD34+CD38-CD123+為靶細胞,按不同效靶比,不同抗體濃度設組,以PBS,抗CD3/抗CD19雙功能抗體為對照,另設CD123-的k562細胞為非相關靶細胞組,比較融合蛋白介導的特異性體外殺傷活性。取上述殺傷實驗效靶比25:1,融合蛋白濃度500ng/ml各組,實時定量PCR檢測各組穿孔素(Perforin)和顆粒酶A(Granzyme A)的釋放。
　　 結果：基因重組質粒pAYZCD3*/IL3、p

9、AYZCD3/IL3、pAYZ CD3*/m2IL3、pAYZ CD3/m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3經(jīng)測序證實序列正確,構建成功?？笴D3*/IL3在原核表達系統(tǒng)中進行可溶性表達過程中發(fā)現(xiàn),表達產(chǎn)物經(jīng)6×His-tag蛋白純化柱純化,濃縮后,12％SDS-PAGE顯示在27kD,30KD和57kD各有一條帶,但western-blot顯示在30KD和57kD均有帶,與預測結果一致。但后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)pAY

10、ZCD3*/IL3、pAYZCD3/IL3的穩(wěn)定性差,極易發(fā)生沉淀和降解。流式檢測發(fā)現(xiàn)該蛋白與CD3單抗HIT3A有競爭活性,但與抗CD123單抗競爭活性很弱；ELISA檢測結果發(fā)現(xiàn),純化蛋白中活性IL3的含量很低,約為蛋白定量結果的104分之一,所以我們推測IL3的一端發(fā)生了斷裂或蛋白構象發(fā)生了變化。改造后的抗CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3非還原性SDS-PAGE中,在57KD、30kD和27KD有條,western-bl

11、ot在57KD和30KD顯示有帶；還原性SDS-PAGE顯示57KD帶消失,在30kD和27kD各有一條帶,western-blot在30kD顯示有帶,這些均與理論相符。57KD為二硫鍵穩(wěn)定的二聚體,在還原劑巰基乙醇作用下二硫鍵斷開,形成30kD和27kD的2條帶。表達產(chǎn)物經(jīng)純化定量抗CD3*-m2IL3可達1mg/L,抗CD3*-⊿IL3可達2mg/L。FACS檢測四種融合蛋白均可與CD123+M07e細胞和CD3+Jurkat細胞特

12、異結合,并能競爭性抑制單抗AntiCD123和HIT3a與上述細胞的結合。體外血清穩(wěn)定性實驗結果抗CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL337℃72h后活性基本不變,而抗CD3-m2IL3、抗CD3-⊿IL3則遞減至消失,證明引入二硫鍵可增加蛋白的穩(wěn)定性。
　　 抗CD3*-m2IL3、抗CD3-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3、抗CD3-⊿IL3體外介導T細胞殺傷靶細胞TF1、M07e細胞的效果比對照組明顯(p<0.05),

13、激活T細胞釋放Perforin和Granzyme A的量均明顯高于對照組(p<0.05)。
　　 結論：本實驗成功構建了pAYZCD3*/IL3、pAYZCD3/IL3、pAYZ CD3*/m2IL3、pAYZCD3/m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3的表達載體并獲得了可溶性表達,改造后的抗CD3*/m2IL3、抗CD3/m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3,其穩(wěn)定性或活性均有明顯提