Slit2和P-selectin在轉(zhuǎn)基因鼠自發(fā)胰腺癌中的作用研究.pdf

1、腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展是一個(gè)由多種基因的表達(dá)變化和許多生理性調(diào)節(jié)共同作用的復(fù)雜過程。大量研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí):從正常細(xì)胞發(fā)生惡變，直到腫瘤形成的過程中其所在位置的微環(huán)境對(duì)這一過程的影響至關(guān)重要。即腫瘤組織周邊的基底膜的組織結(jié)構(gòu)，血管和淋巴管系統(tǒng)，游離在組織間隙中的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板等諸多成員的生理功能對(duì)腫瘤病程的發(fā)展和腫瘤細(xì)胞病理過程的調(diào)節(jié)都會(huì)有巨大的影響。 遺傳工程小鼠模型（Genetically engineered mouse

2、, GEM）是當(dāng)前用于人類疾病生物學(xué)研究的相對(duì)理想的模型，它有著其它疾病模型無法比擬的優(yōu)勢(shì)。其中，Rip1-Tag2自發(fā)形成胰島細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)基因小鼠模型是用以研究腫瘤的經(jīng)典動(dòng)物模型。首先，腫瘤在小鼠器官內(nèi)的形成是自然發(fā)生的，腫瘤的自然生長(zhǎng)率和轉(zhuǎn)移特性與人類相似；其次，該模型的病例進(jìn)程已經(jīng)得到了充分的研究,為研究其他外加因素對(duì)自發(fā)胰腺瘤的影響提供了良好的對(duì)照；再次，在Rip1－Tag2小鼠身上可以進(jìn)行進(jìn)一步的基因操作?？梢酝ㄟ^雜交得到帶有其

3、他基因缺陷或過表達(dá)其他基因的小鼠。這為從整體動(dòng)物水平來研究各種基因?qū)δ[瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響和機(jī)制提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。 神經(jīng)導(dǎo)向因子Slit2作為促腫瘤血管生成因子來調(diào)節(jié)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的現(xiàn)象在裸鼠移植瘤模型中已經(jīng)得到證實(shí)，但是裸鼠移植瘤模型是“人為”所形成，不能精確地模擬體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)特性。而細(xì)胞粘連分子P-selectin缺失后抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的現(xiàn)象也已經(jīng)在裸鼠移植腫瘤模型中被發(fā)現(xiàn)，但是其機(jī)制尚未得到研究，而且同樣存在模型上的

4、缺陷。本研究以Rip1-Tag2轉(zhuǎn)基因鼠模型為研究載體，探索這兩種基因——Slit2和P-selectin對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)功能，從而探討其影響胰腺瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的病理過程的機(jī)制。主要研究方法和結(jié)果如下： 1、 Slit2基因的過表達(dá)對(duì)原發(fā)性胰島細(xì)胞瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響首先將Rip1-Tag2小鼠和Slit2過表達(dá)小鼠雜交，建立Slit2/Rip1-Tag2遺傳工程小鼠腫瘤模型。以普通Rip1-Tag2小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

5、通過對(duì)兩組小鼠血性胰島的發(fā)生數(shù)目，胰腺腫瘤的發(fā)生數(shù)目以及胰腺腫瘤體積的比較分析，證實(shí)Slit2分子的過表達(dá)促進(jìn)了機(jī)體自發(fā)胰腺腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)；通過BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)slit2分子的過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖程度；通過血管塑形證實(shí)slit2分子的過表達(dá)增加了腫瘤新生血管的密度。而通過對(duì)兩組小鼠外周血及腫瘤周邊白細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較分析，發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo1信號(hào)并沒有影響到轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)白細(xì)胞的遷移行為，因而可以排除白細(xì)胞對(duì)腫瘤的

6、影響作用。同時(shí)，通過對(duì)Slit2/Rip1-Tag2小鼠腫瘤病程的觀察，發(fā)現(xiàn)在病程晚期，腫瘤轉(zhuǎn)移至腸系膜，并且轉(zhuǎn)移率高達(dá)25％，而普通Rip1-Tag2小鼠轉(zhuǎn)移率＜0.02％；對(duì)兩組小鼠的胰腺腫瘤及淋巴結(jié)進(jìn)行淋巴內(nèi)皮的LYVE-1和Prox－1染色，經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)slit2過表達(dá)促進(jìn)了淋巴管的增生；而對(duì)Slit2/Rip1-Tag2小鼠血管分布密集的器官進(jìn)行H－E染色，未發(fā)現(xiàn)有腫瘤轉(zhuǎn)移灶。 2、 P-selectin基因的缺失

7、對(duì)原發(fā)性胰島細(xì)胞瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響首先將Rip1-Tag2小鼠和P-selectin敲除小鼠雜交，建立P-selectin KO/Rip1-Tag2遺傳工程小鼠腫瘤模型。以普通Rip1-Tag2小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。通過對(duì)兩組小鼠血性胰島的發(fā)生數(shù)目，胰腺腫瘤的發(fā)生數(shù)目以及胰腺腫瘤體積的比較分析，證實(shí)P-selectin的缺失抑制了機(jī)體自發(fā)胰腺腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)；通過BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)P-selectin分子的缺失抑制了腫瘤細(xì)胞

8、的增殖程度；通過血管內(nèi)皮的特異性染色發(fā)現(xiàn)P-selectin分子的缺失減少了腫瘤新生血管的密度；通過血小板的CD41染色發(fā)現(xiàn)P-selectin分子的缺失抑制了血小板血栓的形成。而通過對(duì)兩組小鼠外周血及腫瘤周邊白細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較分析，發(fā)現(xiàn)在此腫瘤模型中，P-selectin的缺失并未影響外周血中白細(xì)胞的密度，而腫瘤組織周邊游離白細(xì)胞數(shù)目顯著減少，即機(jī)體對(duì)腫瘤的細(xì)胞免疫反應(yīng)削弱了。然而腫瘤的總體進(jìn)程依然呈現(xiàn)出延緩的趨勢(shì)。 結(jié)