Sal等中藥有效成分在氧化應(yīng)激中的保護(hù)作用.pdf

1、[目的] 氧化應(yīng)激與過氧化物積聚是導(dǎo)致多種疾病(如腦缺血、Alzheimer's病(AD)、腦動(dòng)脈粥樣硬化等)的根本原因。H2O2是氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的活性氧之一，其主要產(chǎn)物OH-具有很強(qiáng)的氧化性并可自由進(jìn)入細(xì)胞，破壞細(xì)胞內(nèi)活性氧和抗氧化代謝的平衡，使抗氧化酶等活性下降，同時(shí)會損傷體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子，造成細(xì)胞內(nèi)酶活力變化、代謝紊亂、DNA損傷和細(xì)胞調(diào)亡。機(jī)體自身具有清除或修復(fù)氧化損傷的能力，例如超氧化物歧化酶

2、(SOD)和過氧化物酶(POD)是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶系之一，其作用在于清除體內(nèi)的自由基。無嘌呤/無嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子-1(apurinic/apyrimidinic endonuclease/redoxfactor-1，APE/Ref-1)是一種多功能的蛋白，在DNA堿基切除修復(fù)(BER，baseexcise repair)、對轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原調(diào)控和活性氧簇的調(diào)控等多個(gè)重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用，是參與DNA氧化損

3、傷修復(fù)的重要抗氧化酶。因此，提高機(jī)體氧化損傷時(shí)抗氧化酶的表達(dá)/活性將有利于對上述疾病的預(yù)防及治療。 近年來研究表明，我國很多中藥成分具有抗氧化、改善血液流變學(xué)等對人體有利的作用，但其抗氧化作用機(jī)制目前仍在研究之中。本文建立了用于篩選抗氧化藥物的細(xì)胞模型，對幾十種中藥有效成份進(jìn)行篩選，并對中藥紅景天的主要成分紅景天甙(Salidroside，Sal)的抗氧化應(yīng)激作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)觀察與分析，對APE/Ref-1的表達(dá)與過

4、氧化氫導(dǎo)致PC12細(xì)胞損傷的關(guān)系進(jìn)行研究，為氧化應(yīng)激損傷引起的老年性心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。 [方法] 1．抗氧化藥物篩選模型的建立：用PC12細(xì)胞，以不同的濃度H2O2(設(shè)0，50，100，200，300，400μM)孵育細(xì)胞1h及用200μM H2O2分別作用30 min、1h、2h、4h、6h、12h，然后采用MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞存活檢測。選用維生素E為抗氧化應(yīng)激陽性對照藥物，建立細(xì)胞模型

5、，用于抗氧化藥物的篩選。 2．抗氧化中藥藥物成分的篩選：運(yùn)用所建立的細(xì)胞抗氧化模型，先用不同濃度的中藥藥物成分與PC12細(xì)胞共孵育30 min，再加入終濃度為200μM的H2O2作用1小時(shí)，對50種中藥成分進(jìn)行抗氧化保護(hù)作用的篩選。 3．紅景天甙的抗氧化損傷保護(hù)作用及其機(jī)制探討：選擇其中抗氧化作用較為明顯的中藥紅景天的提取物紅景天甙，對其抗氧化保護(hù)作用進(jìn)行進(jìn)一步探討。紅景天甙抗氧化作用的作用機(jī)制如何?我們猜測，紅景天甙的

6、抗氧化保護(hù)作用在細(xì)胞水平可能與提高細(xì)胞對氧化損傷的耐受性、減輕細(xì)胞受損、和促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)。為探討其保護(hù)作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)選用1，10，100μM三個(gè)濃度的紅景天甙對PC12細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理30 min，設(shè)正常對照組和氧化損傷組(加入終濃度為200μM的H2O2作用1h)，通過MTT、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及臺盼藍(lán)染色等方法，觀察其抗氧化損傷作用，通過BrdU摻入后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖情況，并用WesternBlot方法觀察細(xì)胞內(nèi)APE/Ref-1

7、的表達(dá)變化，分析紅景天甙抗氧化損傷作用的可能機(jī)制。 [結(jié)果] 1．MTT法檢測試PC12細(xì)胞進(jìn)行H2O2氧化損傷處理情況，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)處理1h后，200，300，400μM H2O2可以引發(fā)細(xì)胞損傷，細(xì)胞存活出現(xiàn)明顯降低，其損傷程度呈現(xiàn)濃度依賴性；用200μM H2O2處理后，細(xì)胞損傷呈時(shí)間依賴性變化。陽性對照藥物維生素E可以減輕氧化引發(fā)的細(xì)胞損傷，并具有劑量依賴性，由此成功建立抗氧化損傷的篩藥模型。 2．采用上一步

8、建立的PC12細(xì)胞模型，將不同濃度的藥物與PC12細(xì)胞共孵育30min，采用200μM的H2O2作用1h后，進(jìn)行50種藥物成分的篩選，先后共發(fā)現(xiàn)34種有效中藥藥物成分具有抗氧化作用。我們從中選取抗氧化作用較為明顯的紅景天甙作為下一步的研究。 3．紅景天甙的抗氧化保護(hù)作用及其機(jī)制探討 (1)與正常對照組比較，200μM的H2O2作用1h后，細(xì)胞存活率明顯降低；0.5μM，1μM的紅景天甙在細(xì)胞氧化損傷后細(xì)胞存活率略有升高，

9、10μM和100μM的紅景天甙能明顯提高細(xì)胞在氧化損傷后的存活率，而200μM和400μM的紅景天甙對細(xì)胞的保護(hù)作用并不明顯。 (2)采用倒置相差顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，可以看到，氧化損傷組引起細(xì)胞發(fā)生水腫，部分細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)空洞等壞死性癥狀；1，10，100μM的紅景天甙均可減輕低氧后引發(fā)的形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞水腫減輕、結(jié)構(gòu)相對完整等。 (3)臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，損傷組PC12細(xì)胞死亡率明顯升高，而1，

10、10，100μM的紅景天甙抑制了氧化損傷后細(xì)胞死亡率的升高，且有濃度依賴性。 (4)用BrdU摻入流式細(xì)胞方法測定細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，經(jīng)紅景天甙處理后的PC12細(xì)胞，相對于未加藥組出現(xiàn)不同程度的增殖，且其增殖與紅景天甙藥物濃度成正比，進(jìn)一步證明紅景天甙具有促細(xì)胞增殖作用。 (5)采用Western Blot方法觀察細(xì)胞內(nèi)APE/Ref-1的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，H2O2損傷使APE/Ref-1表達(dá)急劇降低。 [

11、結(jié)論] 1．建立了抗氧化應(yīng)激藥物篩選的細(xì)胞模型，并運(yùn)用其進(jìn)行了大量藥物篩選，從50種中藥有效成分中先后篩選出具34種具有抗氧化作用的藥物成分。紅景天甙是其中含較量高且抗低氧化應(yīng)激作用較為顯著的藥物成分之一。 2．紅景天甙對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用； 3．首次在細(xì)胞水平證實(shí)紅景天甙的抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用可能與其促進(jìn)細(xì)胞增殖作用有關(guān)。 4．在PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，APE/Ref-1