石參有效成分對胰島細胞及肝細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，我國糖尿病(DM)已躍居繼美國后的世界第二位患病大國，成年人群中糖尿病患病率達到3.5％左右，總?cè)藬?shù)超過4000萬人;并且以每年0.1％的速度增長，而其中90％為Ⅱ型糖尿病(T2DM)。面對我國Ⅱ型糖尿病流行的嚴峻現(xiàn)狀，中國糖尿病防治指南多次明確提出，目前我國Ⅱ型糖尿病防治面臨的主要挑戰(zhàn)和任務(wù)之一，就是降低Ⅱ型糖尿病的發(fā)病率，對Ⅱ型糖尿病進行早期干預(yù)。
　　 Ⅱ型糖尿病早期

2、共同的特點是糖耐量減低(impaired glucose tolerance，IGT)和/或空腹血糖受損(Impaired fasting glucose，IFG)。IGT/IFG是介于正常血糖與糖尿病之間的一種糖代謝異常，是Ⅱ型糖尿病自然病程中一個階段。正常空腹血糖為3.9-5.6 mmol/L，糖尿病時空腹血糖≥7 mmol/L。IGT表現(xiàn)為口服葡萄糖糖耐量試驗(OGTT)時，其空腹血漿葡萄糖＜7.0 mmol/L，口服葡萄糖后2h

3、血糖7.8-11.1mmol/L，而空腹血糖在5.6-7.0 mmol/L之間時診斷為IFG。胰島素抵抗（IR）和胰島素分泌缺陷是IGT/IFG的主要原因。其中，IGT主要與胰島素分泌缺陷有關(guān)，而IFG主要與IR有關(guān)。許多研究證明，IR和胰島素分泌缺陷與血脂(尤其是游離脂肪酸，F(xiàn)FA)升高有關(guān)。
　　 目前IGT/IFG防治主要提倡飲食和生活方式干預(yù)。近年來，也有報道用小劑量二甲雙胍、匹格列酮或阿卡波糖等進行IGT/IFG干預(yù)治

4、療，能明顯預(yù)防糖尿病和心血管并發(fā)癥。但由于不良反應(yīng)多，再加上相當一部分IGT/IFG患者不會發(fā)展為Ⅱ型糖尿病，因此，口服降糖藥早期干預(yù)還需要進行風(fēng)險評估。
　　 而中醫(yī)認為IGT/IFG類似于脾癉，脾癉的后果是轉(zhuǎn)為消渴。中醫(yī)對IGT/IFG治療最主要的方法還是以辨證辨病結(jié)合治療為主，辨證分型尚處于初期探索性階段，缺乏規(guī)范的臨床試驗。IGT/IFG是發(fā)揚中醫(yī)藥治療優(yōu)勢的潛在病種，它是糖尿病發(fā)病前期的“亞健康狀態(tài)”，符合中醫(yī)治未病的

5、思想，適合長期治療。故挖掘和應(yīng)用中藥、天然藥物治療IGT/IFG前景廣闊，具有很好的實用價值。
　　 石參(Uraria crinita)是豆科貍尾豆屬的多年生直立亞灌木植物，主要分布于我國南方沿海省份，包括廣東、廣西、海南、福建、臺灣。《廣西中藥志》中記載:其味甘，性溫，無毒;歸肺、胃二經(jīng);行氣痛，逐瘀化痰，治心胃氣痛，有清熱解毒、滲濕的功效。民間用于治療胃炎、浮腫、風(fēng)寒感冒等，我國南方常用作湯劑或燉劑，常食有保健作用，是效果

6、良好的藥材和藥膳材料，享有“北有人參，南有石參”的美譽。
　　 為了進一步探討石參的有效部位，我們對石參進行乙酸乙酯、乙醇和水梯度提取，觀察了提取物對高脂飼料+小劑量鏈脲霉素誘導(dǎo)的C57BL/6J糖尿病小鼠的作用，結(jié)果表明，18g藥材/kg的石參乙酸乙酯、乙醇和水梯度提取物，對模型小鼠非空腹血糖降糖效果依然不明顯，但顯著降低空腹血糖，分別降低25％、33％和27.3％，而對照組消渴丸1500mg/kg降低空腹血糖的水平為12％。

7、3種提取物對血漿胰島素水平無明顯影響，但有不同程度降低游離脂肪酸(FFA)和甘油三酯(TG)的作用，尤其是乙醇提取物降低游離脂肪酸(FFA)的作用達54％，對照組消渴丸為33％。表明石參提取物中，有多種成分參與了改善IGT/IFG作用，該作用與降低血脂，尤其是降低游離脂肪酸(FFA)的有關(guān)。其中，最明顯的為乙醇提取物。
　　 2009年，華中科技大學(xué)同濟藥學(xué)院和湖北省天然藥物化學(xué)與資源評價重點實驗室對石參化學(xué)成分進行了分離鑒定，

8、從10kg石參根粗粉乙醇提取物中分離并鑒定了14個化合物，總含量為143mg。其中，已報道有明顯降糖作用、可用于糖尿病治療的化合物包括染料木素(14mg)、水飛薊賓(8mg)和白樺脂醇(11mg)，這3種化合物含量占總提取物含量的23.1％。我們認為，石參乙醇提取物效果更好的原因可能與這些成分有關(guān)。
　　 已知的石參提取物中，黃酮類化合物幾乎占40％。眾所周知，黃酮類有較強的抗氧化作用，為了評價石參中黃酮類的抗氧化活性，我們提取

9、了石參總黃酮，研究其體外抗氧化活性及對大鼠胰島瘤細胞(INS-1E)氧化應(yīng)激的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石參總黃酮體外對DPPH、ABTS、·OH自由基、H2O2、NO等自由基和脂質(zhì)過氧化有明顯抑制作用，并具有濃度依賴性。能顯著提高氧化應(yīng)激下的INS-1E細胞的存活率，提高谷胱甘肽(GSH)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的含量。說明石參總黃酮具有清除自由基活性，對胰島β-細胞氧化應(yīng)激有保護作用。<

10、br>　　 以上分析說明，石參提取物中，染料木素、水飛薊賓和白樺脂醇這幾種重要成分對IGT/IFG的改善作用可能通過4種途徑，即降血脂、增加葡萄糖利用、抗氧化和促進胰島素釋放。而且，這幾種成分通過多靶點作用，可能起到了協(xié)同效應(yīng)。因為單一成分有效劑量都在每公斤體重（鼠）幾十到幾百毫克級，而我們給石參的量，按5-20mg/10kg藥材的提取率算，大約是每公斤體重（鼠）幾十微克，即使實際含量增加10倍，石參提取物中各成分的含量與文獻報道的單

11、一有效量也相差10-100倍以上，但改善IGT/IFG和降低脂肪酸效果相似，說明石參提取物中多種成分之間起了協(xié)同作用。
　　 基于以上假設(shè)，本課題將在前期工作基礎(chǔ)上，用不同的細胞，研究石參總黃酮及有效成分染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇聯(lián)合用藥逆轉(zhuǎn)體外細胞糖尿病模型的效果，為石參及其有效部位和有效成分用于Ⅱ型糖尿病早期預(yù)防提供安全、有效的措施和依據(jù)，對發(fā)掘應(yīng)用中藥預(yù)防Ⅱ型糖尿病，降低本病發(fā)病率有重要的意義。
　　 方法:

12、r>　　 1.RIN-m細胞氧化應(yīng)激損傷及石參總黃酮的保護作用
　　 指數(shù)生長期的RIN-m細胞接種于96孔板中，每孔1*104個細胞，用0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/ml等濃度的石參總黃酮處理細胞后，再用濃度為10mM的SNP構(gòu)建損傷模型，然后用MTT法在570nm處檢測細胞活力。
　　 2.石參總黃酮對RIN-m細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下SOD活性，MDA，GSH和細胞內(nèi)外液NO含量的影響
　　

13、 指數(shù)生長期的RIN-m細胞接種于24孔板中，每孔1*105個細胞，用0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/ml等濃度的石參總黃酮處理細胞后，再用濃度為10mM的SNP構(gòu)建損傷模型，然后收集細胞上清液和細胞破碎液，用相應(yīng)試劑盒檢測MDA，GSH，NO含量和SOD活性。
　　 3.HEPG2細胞胰島素抵抗及染料木素、水飛薊賓和白樺脂醇聯(lián)用對模型的逆轉(zhuǎn)效果
　　 指數(shù)生長期的HEPG2細胞接種于96孔板中，每孔1

14、*104個細胞，用總濃度為1、0.5、0.25 nM的染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇的復(fù)方藥物和0.25 mM的軟脂酸一起處理細胞12h，然后用含有1*10-7M胰島素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8h，然后用葡萄糖檢測試劑盒檢測上清中葡萄糖含量，再在570nm波長處檢測細胞活力。
　　 4.INS-1E細胞脂肪酸損傷模型構(gòu)建及染料木素、水飛薊賓和白樺脂醇聯(lián)用對模型的逆轉(zhuǎn)效果
　　 指數(shù)生長期的INS-1E細胞接種于96孔板中，每孔

15、1*104個細胞，用總濃度為2、1nM的染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇的復(fù)方藥物和0.5mM的軟脂酸一起處理細胞24 h，然后用MTT法在570nm波長處檢測細胞活力。
　　 結(jié)果:
　　 1.石參總黃酮對RIN-m細胞氧化應(yīng)激保護實驗研究顯示，10mM的SNP作用4小時后能顯著的損傷細胞(P＜0.05)，而不同濃度的石參總黃酮皆能顯著的提高模型的細胞活力(P＜0.05)。
　　 2.石參總黃酮能在一定濃度下對RI

16、N-m細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下MDA，GSH的含量和SOD活性產(chǎn)生改善作用，但只有在高劑量下才能對細胞內(nèi)外液NO含量產(chǎn)生顯著影響。石參總黃酮對RIN-m細胞的氧化應(yīng)激具有一定的保護作用，其主要原因可能是由于其對GSH含量的影響和對SOD活力的改善。
　　 3.染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇的聯(lián)合給藥能在比單體給藥較低的濃度就能顯著的改善軟脂酸誘導(dǎo)的HEPG2細胞胰島素抵抗(P＜0.05)，提高在胰島素存在下細胞對葡萄糖的利用，且這種提高

17、并不通過提高細胞活力而達到，因此推斷是藥物改善了細胞胰島素的敏感性而致。
　　 4.染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇的聯(lián)合給藥能顯著的改善軟脂酸誘導(dǎo)的INS-1E損傷，但復(fù)方給藥和單體給藥之間并無顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 石參總黃酮對胰島細胞的氧化應(yīng)激損傷具有明顯的保護效果，能有效的改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細胞MDA，GSH含量和SOD活性。而石參總黃酮中主要的染料木素，水飛薊賓和白樺脂醇聯(lián)用能在不影響細胞活力的