人臍帶間充質(zhì)干細胞移植對腦出血后細胞凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　腦出血是一種高發(fā)病率、高致殘率和高病死率的腦血管疾病。在亞洲國家，腦出血占所有卒中的20-30％，其中有30-40％在急性期死亡。腦出血后引起血腫周圍腦組織損傷，主要由于血腫的占位效應和直接損傷，其他包括血腫周圍組織缺血、繼發(fā)炎癥反應、紅細胞溶解產(chǎn)生的血紅蛋白所誘導的毒性反應直接破壞周圍腦組織，神經(jīng)元凋亡及等因素引起腦組織水腫、移位和損傷，其中P53,Bcl-2和Bax基因在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，從而出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功

2、能缺損癥狀和體征。因此，研究腦出血的治療非常重要。近年來，腦出血微創(chuàng)清除術(shù)受到關(guān)注，微創(chuàng)治療可以在腦出血早期減輕血腫對周圍腦組織的壓迫，解除占位效應，減少炎癥介質(zhì)，避免直接的化學刺激，從而緩解腦組織繼發(fā)損傷。但神經(jīng)元是不可再生細胞，單純血腫抽吸治療腦出血，并不能從根本上促進神經(jīng)功能的恢復。臍帶血間充質(zhì)干細胞(HUC-MSCs)具有多項分化潛能，HUC-MSCs用于腦卒中的治療實驗研究表明，神經(jīng)生長因子的分泌，減輕炎癥反應，減少細胞凋亡等

3、機制促進了神經(jīng)功能恢復。
　　目的:
　　本實驗采用微創(chuàng)血腫清除術(shù)、微創(chuàng)血腫清除術(shù)聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠出血性腦卒中，探討HUC-MSCs細胞移植對細胞凋亡和對神經(jīng)功能恢復的影響，探索治療方案可行性，為急性期臨床治療出血性腦卒中提供實驗依據(jù)。
　　方法共納入120只SD大鼠，隨機分為4組:(1)對照組（Control組）:用骨鉆在顱骨鉆孔，于定位穿刺點用微量進樣器穿刺右側(cè)尾狀核區(qū);(2)腦出血組（ICH組）:

4、麻醉后固定于腦立體定位儀，骨鉆定位鉆孔，于穿刺點用微量進樣器注射Ⅳ型膠原酶入右側(cè)尾狀核區(qū);(3)微創(chuàng)血腫清除組（MIS組）腦出血大鼠模型造模成功6小時后，用自制血腫清除裝置行微創(chuàng)血腫清除術(shù);(4)細胞移植治療組(MSC組)腦出血大鼠模型行微創(chuàng)血腫清除術(shù)后同部位注入HUC-MSCs懸液。每組大鼠分別于ICH建模后1d、2d、5d、9d、14 d和21d處死，每個時間點5只大鼠。臍帶取自足月剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦，分離、培養(yǎng)、分化干細胞，BrdU標

5、記HUC-MSCs。腦出血模型制備成功后6h行微創(chuàng)血腫清除術(shù)和HUC-MSCs移植。肝素化生理鹽水注入右心耳，大鼠僵化后斷頭取腦，固定腦組織。腦組織切片以備免疫組織化學染色。檢測細胞CD29，CD34，CD44, CD90和CD105的表達，鑒定間充質(zhì)干細胞。檢測P53，Bcl-2和Bax在腦組織的表達，反映細胞凋亡情況。采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。檢測數(shù)據(jù)以均值±標準差((x)±s)方式表示，P＜0.05時被認為組間

6、差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)分離培養(yǎng)的HUC-MSCs干細胞，在顯微鏡下呈長纖維狀排列。HUC-MSCs細胞體外分離、培養(yǎng)、免疫細胞化學染色，通過觀察，CD44、CD29、CD90、CD105陽性表達，而CD34陰性表達，表明分離培養(yǎng)的細胞符合間充質(zhì)干細胞的特點，鑒定為HUC-MSCs干細胞。共計120只腦出血模型大鼠Bederson評分大于2分，建模成功。大鼠移植血腫部位接受BrdU標記的HUC-MSCs細胞移植

7、后，采用免疫組織化學的方法進行研究，發(fā)現(xiàn)在1d到21d均可見到BrdU染色陽性的細胞，并且在血腫周圍組織、顳葉海馬區(qū)及大腦皮質(zhì)區(qū)有染色陽性細胞，而Control組、ICH組和MIS組腦組織內(nèi)免疫組化未顯示陽性細胞，表明在細胞移植后，HUC-MSCs細胞能夠成活并遷徙到血腫附近及遠隔組織。ICH組、MIS組和MSC組在每個時間點mNSS評分均顯著低于control組(P＜0.05);從2d開始，MIS組和MSC組在每個時間點mNSS評分均

8、顯著低于ICH組(P＜0.05); MSC組較MIS組在5d、9d、14d和21d評分低(P＜0.05)。腦組織免疫組化結(jié)果顯示，腦出血后3個干預組與對照組相比，在每個時間點P53表達陽性數(shù)均有明顯差別(P＜0.05); MSC組在1d、2d時與MIS組之間無統(tǒng)計學差異，MSC組在5d、9d、14d和21d時P53陽性表達低于MIS組(P＜0.05)，在2d、5d、9d、14d和21 d時，MIS組P53陽性表達低于ICH組(P＜0.0

9、5)。與對照組相比，從術(shù)后5d開始，ICH組、MIS組和MSC組在每個時間點Bcl-2表達陽性率均有明顯增強(P＜0.05); MSC組在9d、14d和21d時Bcl-2陽性表達明顯高于MIS組(P＜0.05); MIS組Bcl-2陽性表達在5d、9d、14d和21d時高于ICH組。MSC組在5d、9d、14d和21d時陽性表達低于MIS組(P＜0.05)，在2d、5d、9d、14d和21d時，MIS組Bax陽性表達低于ICH組(P＜0

10、.05)。腦出血后P53和Bax的表達在1d達高峰，第5d表達逐漸減少。Bcl-2的表達在2d時達高峰，第5d維持在高表達狀態(tài)，隨后表達逐漸減少。
　　結(jié)論:
　　腦出血導致血腫周圍腦組織凋亡相關(guān)基因的表達。細胞移植后，HUC-MSCs細胞可以在血腫周圍存活并遷移到遠隔組織。P53、Bax、Bcl-2表達主要集中于血腫周圍組織、皮質(zhì)、皮質(zhì)下和海馬區(qū)的胞漿內(nèi)。微創(chuàng)血腫清除和微創(chuàng)術(shù)后HUC-MSCs細胞移植都增加血腫周圍腦組織B