中樞Ⅰ型囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系的初步研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，由于其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，加之腦內(nèi)所形成的病理改變逆轉(zhuǎn)十分困難，因此，給臨床治療和防治AD藥物的研究與開(kāi)發(fā)帶來(lái)了極大的困難，至今尚無(wú)理想的治療藥物問(wèn)世。由于AD屬于多基因復(fù)雜性疾病，多種基因及其表達(dá)產(chǎn)物在其中樞認(rèn)知功能障礙發(fā)生的病理生理過(guò)程中具有重要調(diào)控作用。因此，研究、闡明這些重要調(diào)控基因的功能對(duì)于揭示AD的發(fā)病機(jī)理以及防治AD藥物靶標(biāo)的

2、發(fā)現(xiàn)和研究均具有重要意義。 囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(Vesicular glutamate transporter,VGLUT)是神經(jīng)元囊泡谷氨酸遞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)體，目前有3種類(lèi)型被鑒定。其中VGLUIT1主要在神經(jīng)元富集區(qū)如大腦皮層和海馬中表達(dá)，并選擇性地位于興奮性谷氨酸能神經(jīng)元突起末端的突觸囊泡上，擔(dān)負(fù)著將囊泡外谷氨酸運(yùn)輸進(jìn)突觸囊泡內(nèi)，并在突觸中調(diào)節(jié)這種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及在后續(xù)生理過(guò)程中的重要功能，是谷氨酸能神經(jīng)元及其軸突末端高度特

3、異的標(biāo)志物。VGLUT1表達(dá)水平的變化對(duì)于谷氨酸突觸傳遞的效能具有重要影響，其表 達(dá)水平則反應(yīng)了谷氨酸能神經(jīng)元及其突觸的數(shù)目、活動(dòng)度以及功能狀態(tài)。但VGLUT1的表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系尚不十分清楚。本室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，給予12月齡快速老化模型小鼠SAMP8連續(xù)口服石杉?jí)A甲和六味地黃湯4周，其海馬VGLUT1的表達(dá)發(fā)生了明顯改變，提示AD治療藥物石杉?jí)A甲和具有益智作用的中藥復(fù)方六味地黃湯對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響與調(diào)節(jié)海馬VGLUT

4、1的表達(dá)具有一定關(guān)系。 快速老化模型小鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)的快速老化亞系SAM-prone/8，SAMP8)的典型特征是隨增齡呈現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙，腦內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)元丟失、Aβ沉積等類(lèi)似AD的病理改變及多種基因的表達(dá)異常，是在基因和蛋白水平研究AD的良好模型。為揭示VGLUT1與學(xué)習(xí)記憶功能的相關(guān)性，探索其做為防治AD藥物篩選靶標(biāo)的可能性，并為后續(xù)研究積累實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本研究以SAM

5、P8為模型，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot以及免疫組化技術(shù)，首先觀(guān)察了SAMP8增齡過(guò)程中海馬和皮層VGLUT1表達(dá)和分布變化，以探討其在學(xué)習(xí)記憶功衰退過(guò)程中表達(dá)變化的規(guī)律；進(jìn)而采用穿梭箱實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察了VGLUT1的表達(dá)與小鼠在條件性回避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中與學(xué)習(xí)記憶獲得的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上，觀(guān)察了對(duì)AD病人或模型動(dòng)物具有良好療效、但功能主治不同的中藥復(fù)方六味地黃湯(LW)、八味地黃湯(BW)、黃連解毒湯(HL)、調(diào)心方(TXF)和

6、當(dāng)歸芍藥散(DSS)，以及目前臨床用于AD治療的藥物石杉?jí)A甲，對(duì)VGLUT1基因和蛋白表達(dá)的影響，以探討其對(duì)防治AD藥物的反應(yīng)性。 一、快速老化模型小鼠增齡過(guò)程中海馬及皮層VGLUT1表達(dá)和分布的變化 SAMP8的典型特征是認(rèn)知功能呈增齡性衰退，為了揭示VGLUT1是否與增齡性認(rèn)知功能衰退相關(guān)，本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot以及免疫組化技術(shù)，觀(guān)察了SAMP8在增齡過(guò)程中海馬和皮層VGLUT1基因和蛋白

7、的表達(dá)變化及分布。 1．APP表達(dá) APP是AD病人腦內(nèi)老年斑主要組成成分Aβ的前體蛋白，已有大量研究表明，APP轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)有明顯學(xué)習(xí)記憶功能障礙，此外，SAMP8在增齡過(guò)程中其腦內(nèi)APP基因和蛋白表達(dá)以及β淀粉樣沉積逐漸增多。因此，本研究以APP表達(dá)為對(duì)照，首先觀(guān)察了SAMP8在增齡過(guò)程海馬和皮層APP基因和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果表明，SAMR1海馬和皮層中APP基因和蛋白的表達(dá)隨增齡無(wú)明顯改變，而SAMP8海馬和皮

8、層APP基因和蛋白表達(dá)則隨增齡逐漸升高；與同月齡SAMR1相比，APP基因和蛋白在2月齡SAMP8海馬和皮層中的表達(dá)無(wú)變化，但在6和12月齡其表達(dá)均明顯高于同齡SAMR1對(duì)照組。 2．VGLUT1表達(dá)和分布的變化 本研究結(jié)果表明，隨著月齡的增加，SAMR1海馬和皮層VGLUT1的基因和蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。而SAMP8海馬和皮層VGLUT1的表達(dá)則呈現(xiàn)出與SAMR1不同的變化規(guī)律，表現(xiàn)為先降低后升高，呈珊‘V’字曲線(xiàn)。

9、即在2月齡時(shí)其表達(dá)與同齡SAMRl相比無(wú)明顯改變，6月齡時(shí)表達(dá)明顯低于2月齡及同齡SAMR1，12月齡時(shí)表達(dá)則恢復(fù)至接近2月齡水平，且與同齡SAMR1相比無(wú)明顯差異。免疫組化觀(guān)察結(jié)果表明，VGLUT1主要存在于皮層、海馬神經(jīng)元的胞質(zhì)與胞膜中，尤其是海馬齒狀回中分布較多。VGLUT1基因和蛋白在SAMRl和SAMP8海馬和皮層中的增齡性表達(dá)變化規(guī)律是相同的，即SAMR1海馬和皮層VGLUT1中分布隨增齡無(wú)明顯改變；SAMP8在2月齡時(shí)其表

10、達(dá)與同齡SAMR1相比無(wú)明顯改變，6月齡時(shí)表達(dá)明顯低于2月齡及同齡SAMR1，12月齡時(shí)表達(dá)則恢復(fù)至接近2月齡水平，與同齡SAMR1相比亦無(wú)明顯差異。 二、VGLUT1表達(dá)與小鼠學(xué)習(xí)記憶獲得的關(guān)系 為進(jìn)一步研究VGLUT1表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系，本研究應(yīng)用反映動(dòng)物條件性回避反應(yīng)學(xué)習(xí)記憶行為能力的穿梭箱實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察了VGLUT1表達(dá)與小鼠學(xué)習(xí)記憶獲得的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)選用雄性小鼠，連續(xù)實(shí)驗(yàn)6天。于實(shí)驗(yàn)第6天結(jié)束后根據(jù)學(xué)習(xí)成績(jī)優(yōu)劣

11、分成6組，并以未進(jìn)行學(xué)習(xí)行為實(shí)驗(yàn)小鼠為對(duì)照。然后觀(guān)察了其海馬和皮層APP和VGLUT1基因和蛋白的表達(dá)的改變，以探討VGLUT1表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶獲得的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，海馬和皮層VGLUT1基因和蛋白表達(dá)量均與學(xué)習(xí)記憶成績(jī)呈明顯正相關(guān)關(guān)系，提示VGLUT1可能參與了學(xué)習(xí)記憶的生理過(guò)程。 三、益智中藥復(fù)方和石杉?jí)A甲對(duì)SAMP8海馬和皮層VGLUT1表達(dá)的影響 已有臨床研究結(jié)果表明，當(dāng)歸芍藥散、調(diào)心方、黃連解毒

12、湯等中藥復(fù)方對(duì)AD病人具有良好的治療效果；大量實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)研究結(jié)果表明，六味地黃湯、八味地黃湯等對(duì)多種原因所致動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能障礙具有明顯改善作用，這些中藥復(fù)方的功效是不同的。石杉?jí)A甲為臨床常用的AD治療藥物。為觀(guān)察VGLUT1對(duì)上述藥物的反應(yīng)性，本研究選用12月齡SAMP8，分別灌胃給予六味地黃湯(10g/kg)、八味地黃湯(10.5g/kg)、當(dāng)歸芍藥散(3.4g/kg)、調(diào)心方(34.7 g/kg)、黃連解毒湯(5 g/kg)和石杉

13、堿甲(5×10<'-6>g/kg)，連續(xù)5周。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot技術(shù)，觀(guān)察了SAMP8海馬及皮層APP和VGLUT1基因和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果表明，與同齡SAMR1相比，SAMP8給水模型組海馬VGLUT1基因和蛋白表達(dá)均明顯升高，皮層VGLUT1表達(dá)水平與SAMR1對(duì)照組無(wú)明顯差異；SAMP8海馬和皮層APP表達(dá)則均較SAMR1對(duì)照組明顯升高。給予中藥復(fù)方和石杉?jí)A甲處理后，SAMP8海馬和皮層VGLUT1基因

14、和蛋白表達(dá)均降低，其中除黃連解毒湯組外，其它各給藥組與SAMP8對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。藥物處理組SAMP8海馬和皮層APP基因和蛋白表達(dá)的結(jié)果與VGLLUT1相似，給藥后均下降，在海馬中除當(dāng)歸芍藥散外，其它給藥組與對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 以上結(jié)果表明，海馬和皮層VGLUT1的表達(dá)隨中樞學(xué)習(xí)記憶功能的衰退和學(xué)習(xí)記憶的獲得而發(fā)生規(guī)律性變化，提示海馬和皮層VGLUT1與中樞學(xué)習(xí)記憶功能具有密切關(guān)系，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常學(xué)習(xí)記憶

15、功能的維持或調(diào)節(jié)過(guò)程。在本文的撰寫(xiě)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)今年4月Neurobiolgy of Aging上于網(wǎng)上刊出了一篇定稿文章，該文報(bào)道了AD病人前腦皮層VGLUT1表達(dá)明顯降低，且與AD病人的認(rèn)知功能低下的程度呈正相關(guān)。該研究結(jié)果支持本研究所作出的結(jié)論。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，SAMP8給予益智藥物后，其海馬和皮層VGLUT1表達(dá)明顯下調(diào)，提示其對(duì)益智藥物治療具有良好的反應(yīng)性，通過(guò)調(diào)節(jié)VGLUT1的表達(dá)可能是上述益智藥物發(fā)揮益智作用的途徑之一

16、。因此，有理由認(rèn)為，VGLUT1具有成為防治AD藥物篩選靶標(biāo)的潛在價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。 大量研究結(jié)果表明，SAMP8在2月齡時(shí)已開(kāi)始出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能的損害，隨后呈進(jìn)行性加重，6月齡時(shí)已十分明顯，12月齡時(shí)更為嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明，SAMP8在增齡過(guò)程中海馬和皮層VGLUT1的表達(dá)變化曲線(xiàn)呈“V”字型，即在2月齡時(shí)與同齡SAMR1無(wú)明顯差異，6月齡時(shí)表達(dá)明顯下調(diào)，隨后又升高，12月齡時(shí)達(dá)到2月齡水平，與同齡SAMR1相比亦無(wú)