復(fù)合功能基因投遞系統(tǒng)的構(gòu)建和體內(nèi)外研究.pdf

1、細(xì)菌磁小體（BMPs）是趨磁性細(xì)菌體內(nèi)依靠生物礦化法合成的磁性納米顆粒，主要由磁核和包被磁核的脂質(zhì)膜兩部分組成。磁小體本身所具有的獨(dú)特性質(zhì)，使其在許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但作為基因載體的應(yīng)用研究還很少。本文通過(guò)對(duì)磁小體的修飾和改性，將其構(gòu)建成具有磁靶向和跨膜復(fù)合功能的基因投遞系統(tǒng)，并在此基礎(chǔ)上使用該基因投遞系統(tǒng)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行體內(nèi)外基因治療實(shí)驗(yàn)，并探討了治療效果。主要研究?jī)?nèi)容如下： ⑴通過(guò)FTIR、XPS、TEM和HRTEM對(duì)

2、磁小體脂質(zhì)膜的組分、官能團(tuán)和微觀形貌進(jìn)行觀察和分析，發(fā)現(xiàn)磁小體具有獨(dú)特的微觀排列形貌和粒徑分布，平均粒徑為45nm，飽和磁化強(qiáng)度為74.33emu/g，并采用熒光胺的方法對(duì)磁小體脂質(zhì)膜上氨基含量進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)每毫克磁小體的脂質(zhì)膜上含有58.58nmol的氨基基團(tuán)；通過(guò)XRD、SQUID和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)磁小體磁核的組分和磁性能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)磁小體的磁核由四氧化三鐵晶體組成，具有較強(qiáng)的磁響應(yīng)性和分散穩(wěn)定性，并通過(guò)ICP-MS分

3、析了磁小體中鐵元素的含量為每毫克磁小體含有0.605mg的鐵元素，含有約3.3549×1012個(gè)磁小體顆粒；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了磁小體具有很好的生物相容性。 ⑵通過(guò)碳二亞胺（EDC·HCI）偶合法，制備出.具有磁靶向的基因投遞系統(tǒng)（BMPs-PAMAM），并優(yōu)化了制備條件，在此基礎(chǔ)上將跨膜多肽（Tat）借助偶聯(lián)劑（Sulfo-LC-SPDP）連接到BMPs-PAMAM磁性粒子表面，制備出具有磁靶向和跨膜復(fù)合功能的基因投遞系統(tǒng)

4、（Tat-BMPs-PAMAM）。通過(guò)FTIR、XPS、Zeta Potential Analyzer、TEM、SQUID和紫外，可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)復(fù)合功能基因投遞系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、組成、微觀形貌和磁性能進(jìn)行了分析表征。定量了每毫克BMPs表面接枝有0.056mg的PAMAM大分子和0.027mg的Tat多肽，大約每個(gè)BMPs上接枝了1472個(gè)PAMAM大分子和3190個(gè)Tat多肽分子。該投遞系統(tǒng)粒徑均勻，約為50nm；具有較強(qiáng)的磁響應(yīng)性和分散

5、穩(wěn)定性，其飽和磁化強(qiáng)度為62.46emu/g。 ⑶凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)證明了兩種基因投遞系統(tǒng)（BMPs-PAMAM和Tat-BMPs-PAMAM）均能夠與報(bào)告質(zhì)粒（pEGFP與pGL-3）形成非常穩(wěn)定的復(fù)合物，并且對(duì)報(bào)告質(zhì)粒具有很好的酶切保護(hù)作用；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了兩種投遞系統(tǒng)具有較好的生物相容性。使用兩種基因投遞系統(tǒng)將兩種報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，結(jié)果顯示，當(dāng)BMPs-PAMAM與報(bào)告質(zhì)粒的質(zhì)量比為20：1、Tat-BMPs-PA

6、MAM與報(bào)告質(zhì)粒的質(zhì)量比為12.5：1時(shí)，均具有最高的轉(zhuǎn)染效率，分別為16.65％和20.56％，并且外加磁場(chǎng)的靶向性作用能夠使兩種基因投遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率提高25％。體外磁靶向跨膜定位實(shí)驗(yàn)證明所制備的兩種復(fù)合功能基因投遞系統(tǒng)（BMPs-PAMAM和Tat-BMPs-PAMAM）具有較好的磁靶向和跨膜復(fù)合功能，其轉(zhuǎn)染效率分別為為11.56％，13.28％，高于商用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染效率9.86％。 ⑷

7、對(duì)兩種基因投遞系統(tǒng)進(jìn)行放射性元素99mTc標(biāo)記，用SPECT考察了兩種投遞系統(tǒng)荷載pGL-3質(zhì)粒的復(fù)合物在正常SD大鼠體內(nèi)分布情況，并詳細(xì)考察了注射方式、Tat多肽和外加磁場(chǎng)對(duì)復(fù)合物在各臟器中分布和跨血腦屏障能力的影響，顯示其磁靶向和跨膜的復(fù)合功能。使用U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型研究了兩種基因投遞系統(tǒng)的體外基因轉(zhuǎn)染對(duì)腫瘤的抑制效果，并與Lipofectamine2000進(jìn)行了對(duì)比。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光、細(xì)胞免疫組化和Western blot檢測(cè)

8、相關(guān)靶蛋白的表達(dá)，證明了Tat-BMPs-PAMAM與Lipofectamine2000對(duì)靶蛋白具有相似的治療效果。體外細(xì)胞生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)兩種基因投遞系統(tǒng)基因治療后的U251細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力均顯著降低，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著上升，并且Tat-BMPs-PAMAM/psiRNA比BMPs-PAMAM/psiRNA具有更好的體外抑制效果，與Lipofectamine2000/psiRNA組相比沒(méi)有顯著性的差異。 ⑸以荷U25