重型肝炎相關基因的RNA干擾質粒的構建及其體內外干預效應的研究.pdf

1、背景及目的:
　　 HBV感染在全世界范圍的流行都非常嚴重，尤其是在發(fā)展中國家和亞太地區(qū)，我國是HBV感染高發(fā)地區(qū)，人群攜帶率高達約10～20%。在亞洲，重型肝炎最主要是由HBV感染引起的，而在歐美國家重型肝炎主要是由酒精性肝炎和藥物性肝炎引起。重型肝炎是急驟發(fā)生廣泛性肝細胞壞死而引起重度肝功能障礙，出現(xiàn)以肝性腦病為主的肝功能衰竭癥狀之高危疾病。該病病情嚴重，發(fā)展迅猛，發(fā)病機制尚不明了，臨床缺乏上特異、有效的治療靶點和干預手段，

2、除非實施緊急肝移植，絕大部分患者預后不良。因此探索重型肝炎肝細胞死亡機制，并開發(fā)針對其發(fā)病機制、阻斷病理衍變過程的基因治療手段正在成為該領域的研究熱點和發(fā)展方向。
　　 肝細胞過度凋亡引起的肝損傷可以引起肝衰竭，并在多種肝病的發(fā)生過程中起重要作用。在生理狀態(tài)下發(fā)生的凋亡主要是清除那些損傷的和多余的細胞,凋亡小體的吞噬不伴隨炎癥反應的發(fā)生。而在病理狀態(tài)下，肝細胞凋亡則有可能引起炎癥反應,出現(xiàn)中性粒細胞的浸潤、肝星狀細胞活化,發(fā)生肝

3、臟纖維化。在重型肝炎的發(fā)病過程中，F(xiàn)as與TNFα系統(tǒng)的激活會促進肝細胞凋亡的發(fā)生。肝細胞的凋亡途徑包括胞膜上死亡受體介導的外部途徑和線粒體介導的內部途徑，肝細胞膜上表達最廣泛的死亡受體是CD95 (APO21PFas)和TNF2a 受體1 (CD120a)。多項研究表明,急慢性肝病中肝細胞的凋亡一般由死亡受體介導。肝細胞對CD120a和CD95介導的凋亡具有高度的敏感性。體外實驗也證實了這一點。在LPS+D-GalN誘導的爆發(fā)性肝衰竭

4、模型中，LPS的毒性實際上是由于嚴重的凋亡性肝損傷和肝細胞完全破壞所引起的。然而，有關肝細胞凋亡在MHV-3誘導的小鼠重型肝炎肝衰竭中的重要作用還未見相關文獻報道，因此研究肝細胞凋亡及其調控機制對重型肝炎肝損傷發(fā)生機理的理解具有重要意義。TNFα是一種由巨噬細胞產生的細胞因子。TNFα對不同的細胞類型發(fā)揮各種不相同的作用，在許多重要的病理和生理過程下作為一重要的介質存在。而且TNFα
　　 還是凋亡的重要介質之一,TNFα的大多

5、數(shù)生物學效應TNFR1介導。TNFR1 胞內區(qū)含死亡結構域，可引起細胞凋亡或者通過激活核轉錄因子NF-KB 使某些細胞增殖、分化，另外也可觸發(fā)信號傳導級聯(lián)而導致細胞凋亡。
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指特異性針對目標基因的同源雙鏈RNA(double-strain RNA，dsRNA)的導入引起目的基因不表達或減效表達，具有高效、特異，快速等優(yōu)點，應用前景廣闊。前期研究發(fā)現(xiàn)通過尾靜脈高壓注射可

6、以使質粒DNA在小鼠肝臟高效表達。尾靜脈高壓注射可將大體積的裸質粒DNA 溶液經小鼠尾靜脈快速注入，大量的質粒溶液導致循環(huán)血量的急劇增加，超過心臟負荷，血液積聚在肝竇中不能回流，延長了質粒DNA 在肝竇中的停留時間，從而被肝組織細胞攝取。因此該方法可以廣泛應用于肝臟疾病基因干預的研究。從基因水平沉默“有害”高表達的基因可以更好地闡明該基因在疾病的發(fā)生發(fā)展中重要作用，也為探索人類重型肝炎臨床治療方法提供新的思路和手段。
　　 具體

7、研究目的如下：
　　 1. 針對重型肝炎發(fā)病關鍵基因mTNFR1 構建siRNA干擾質粒，在中國倉鼠卵巢細胞（CHO）中可以明顯抑制TNFR1基因的表達。
　　 2. 研究mTNFR1shRNA干擾質粒對重型肝炎小鼠體內mTNFR1表達的抑制，改善肝細胞的凋亡情況，生化指標以及對小鼠重型肝炎病情發(fā)展的影響。
　　 3. 針對凋亡相關基因Fas，TNFR1 構建其真核表達載體和microRNA表達載體，并研究在mi

8、RNA 在細胞水平對基因表達的抑制作用。
　　 方法:
　　 1. 構建mTNFR1shRNA干擾質粒和非相關對照質粒，細胞水平分別共轉染mTNFR1shRNA干擾質粒和pEGFP-TNFR1，mTNFR1shRNA干擾質粒和pCDNA3.0-TNFR1，并通過顯微鏡下觀察熒光，RT-PCR、Western blot 技術檢測mTNFR1shRNA干擾質粒的體外干預效應。
　　 2. 采用MHV-3感染Balb/

9、cJ小鼠制造重型肝炎動物模型；通過尾靜脈高壓注射將目的基因導入小鼠肝臟，并檢測目的基因在肝臟的表達效率；mTNFR1shRNA干擾質粒高壓注射后，檢測小鼠肝組織病理、血清生化學變化，并觀察重型肝炎小鼠生存率的改變；通過Real-time PCR、免疫組化檢測mTNFR1shRNA干擾質粒干預后的小鼠肝臟mTNFR1的表達情況；用TUNNEL法檢測肝細胞凋亡情況的改變，并計算凋亡指數(shù)。
　　 3. 構建人類Fas和TNFR1基因的

10、真核表達載體及其miRNA表達載體，并將其共轉染至人293T細胞，通過Real-time PCR和western blot檢測在細胞水平對基因表達的抑制作用。
　　 結果:
　　 1. 成功構建mTNFR1shRNA干擾質粒和非相關對照質粒，并鑒定無誤；分別共轉染mTNFR1shRNA干擾質粒和pEGFP-TNFR1，mTNFR1shRNA干擾質粒和pCDNA3.0-TNFR1至CHO細胞，鏡下可見干預后熒光明顯減弱，R

11、T-PCR、Western blot結果證實mTNFR1shRNA干擾質粒細胞水平顯著抑制mTNFR1的表達。
　　 2. 尾靜脈高壓注射可以將目的基因導入小鼠肝臟，24h 重復注射可以使表達效率提高到40%。mTNFR1shRNA干擾質粒高壓注射后，重型肝炎小鼠生存率從0 提高到13.3%，并顯著改善肝組織病理學變化和血清學指標；mTNFR1shRNA干擾質粒高壓注射后，顯著抑制mTNFR1 在重型肝炎小鼠模型體內的表達，并顯

12、著減少肝細胞的凋亡。
　　 3. 成功構建人類凋亡相關基因Fas，TNFR1的真核表達載體和miRNA干擾質粒，并鑒定無誤；Fas-miRNA和TNFR1-miRNA干擾質粒在細胞水平顯著抑制hFas和hTNFR1的表達。
　　 結論:
　　 1. 本研究利用在線軟件設計合成針對小鼠TNFR1基因的RNA干擾靶序列，通過PCR將其連接于 pMSCV-U6 載體，并通過序列鑒定無誤。構建成功的的mTNFR1shRN

13、A干擾質粒通過轉染CHO細胞，體外實驗證實可以有效且特異地下調目的基因的表達。
　　 2.建立MHV-3誘導的重型肝炎小鼠模型，并通過尾靜脈高壓注射技術將外源基因高效導入小鼠肝臟，mTNFR1shRNA干擾質粒通過下調小鼠肝臟TNFR1基因的表達可以顯著提高小鼠的生存時間和生存率，并且生化指標和肝臟的炎癥均得到明顯改善。為今后重型肝炎、腫瘤、代謝性疾病等凋亡相關的疾病治療提供了一條新途徑。
　　 3. 重型肝炎的肝細胞死