節(jié)律基因mPeriod2抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的體內(nèi)外研究.pdf

1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文節(jié)律基因mPeriod2抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的體內(nèi)外研究姓名：華慧申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學(xué)工程指導(dǎo)教師：王正榮20060420四川大學(xué)博士論文此外，為了解下調(diào)內(nèi)源性m P e r 2 基因表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，我們首先用l O O n MT P A 處理L L C 細(xì)胞以誘導(dǎo)內(nèi)源性m P e r 2 基因表達(dá)，其中一組僅用T P A 處理，一組同時(shí)用T P A 和隨機(jī)反義寡核苷酸，另一組用T P A 和m P

2、 e r 2 反義寡核苷酸處理。處理后2 4 小時(shí)，將細(xì)胞在血清饑餓條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 8 小時(shí)，然后收集細(xì)胞，固定，行流式細(xì)胞分析，檢測(cè)以上三組細(xì)胞凋亡情況。另用R T - P C R 檢測(cè)m P e r 2 基因表達(dá)情況．與僅用T P A 處理組和T P A 聯(lián)合隨機(jī)反義寡核苷酸處理組相比，m P e r 2 反義寡核苷酸處理抑制了T P A 誘導(dǎo)的m P e r 2 基因表達(dá)。流式細(xì)胞分折表明抑制內(nèi)源性m P e r 2 基因表達(dá)可

3、顯著降低血清饑餓所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡．這些結(jié)果從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)了m P e r 2 基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡．為了進(jìn)一步探討節(jié)律基因m P e r 2 過(guò)表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究采用R T - P C R 、蛋白印跡和流式細(xì)胞術(shù)等方法研究m P e r 2 過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠L e w i s 肺癌細(xì)胞株( L L C ) 凋亡相關(guān)基因如p 5 3 ，c - M y c 、B c l - 2 ，B c I - X L和B a

4、x 等基因m R N A 和蛋白表達(dá)的影響。R T - P C R 結(jié)果顯示m P e r 2 過(guò)表達(dá)對(duì)L L C細(xì)胞c - M y c ，B c l - 2 和B c l - X L 基因的m R N A 表達(dá)具明顯的抑制作用，同時(shí)可增強(qiáng)p 5 3 和B a x 基因的m R N A 表達(dá)．蛋白印跡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)都顯示m P e r 2 過(guò)表達(dá)可明顯降低L L C 細(xì)胞c - M y c 、B c l - 2 和B c I ．) (

5、 L 的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)明顯增強(qiáng)p 5 3 和B a x 的蛋白表達(dá)水平．這些結(jié)果表明P E R 2 的促凋亡作用是因?yàn)槠湓鰪?qiáng)了促凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)和削弱了抑制凋亡的基因。除了以上體外試驗(yàn)外，我們也觀察了P E R 2 對(duì)L e w i s 肺癌在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的影響．采用小鼠L e w i s 肺癌細(xì)胞株( U C ) 于C 5 7 B L ／6 小鼠右前肢腋窩皮下接種，建立C 5 7 B L ／6 小鼠移植瘤模型。小鼠以1 2 小時(shí)光照

6、，1 2 小時(shí)黑暗交替( L D l 2 ／1 2 ) 提供光源照制2 周。隨機(jī)分組，雌雄各半．采用p c D N A 3 ．1 ( + ) 與體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑混合物、p c D N A 3 ．1 ( + ) ．m P e r 2 與體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑混合物在移植瘤內(nèi)多點(diǎn)注射．1 0 天后收集標(biāo)本，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組移植瘤細(xì)胞的周期及凋亡率，免疫組化法分析P C N A 蛋白表達(dá)．結(jié)果顯示。p c D N A 3 ．1 ( + ) ．m P

7、e r 2 組瘤重明顯低于p c D N A 3 ．1 ( + ) 對(duì)照組，抑瘤率為5 1 ．7 ％．免疫組化結(jié)果提示p c D N A 3 ．1 ( + ) ．m P e r 2 組P C N A 表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < o ．0 5 ) ．流式細(xì)胞檢測(cè)表明瘤內(nèi)注射p c D N A 3 ．1 ( + ) ．m P e r 2 組細(xì)胞凋亡率分別是生理鹽水組和空質(zhì)粒對(duì)照組的2 ．5 倍和1 ．9 倍。綜上所