節(jié)律基因mPeriod2抑制腫瘤細胞生長的體內外研究.pdf

1、四川大學博士學位論文節(jié)律基因mPeriod2抑制腫瘤細胞生長的體內外研究姓名：華慧申請學位級別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學工程指導教師：王正榮20060420四川大學博士論文此外，為了解下調內源性m P e r 2 基因表達對腫瘤細胞凋亡的影響，我們首先用l O O n MT P A 處理L L C 細胞以誘導內源性m P e r 2 基因表達，其中一組僅用T P A 處理，一組同時用T P A 和隨機反義寡核苷酸，另一組用T P A 和m P

2、 e r 2 反義寡核苷酸處理。處理后2 4 小時，將細胞在血清饑餓條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 8 小時，然后收集細胞，固定，行流式細胞分析，檢測以上三組細胞凋亡情況。另用R T - P C R 檢測m P e r 2 基因表達情況．與僅用T P A 處理組和T P A 聯(lián)合隨機反義寡核苷酸處理組相比，m P e r 2 反義寡核苷酸處理抑制了T P A 誘導的m P e r 2 基因表達。流式細胞分折表明抑制內源性m P e r 2 基因表達可

3、顯著降低血清饑餓所誘導的細胞凋亡．這些結果從另一個側面證實了m P e r 2 基因促進細胞凋亡．為了進一步探討節(jié)律基因m P e r 2 過表達抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡的機制，本研究采用R T - P C R 、蛋白印跡和流式細胞術等方法研究m P e r 2 過表達對小鼠L e w i s 肺癌細胞株( L L C ) 凋亡相關基因如p 5 3 ，c - M y c 、B c l - 2 ，B c I - X L和B a

4、x 等基因m R N A 和蛋白表達的影響。R T - P C R 結果顯示m P e r 2 過表達對L L C細胞c - M y c ，B c l - 2 和B c l - X L 基因的m R N A 表達具明顯的抑制作用，同時可增強p 5 3 和B a x 基因的m R N A 表達．蛋白印跡和流式細胞術檢測都顯示m P e r 2 過表達可明顯降低L L C 細胞c - M y c 、B c l - 2 和B c I ．) (

5、 L 的蛋白表達水平，同時明顯增強p 5 3 和B a x 的蛋白表達水平．這些結果表明P E R 2 的促凋亡作用是因為其增強了促凋亡的信號傳導和削弱了抑制凋亡的基因。除了以上體外試驗外，我們也觀察了P E R 2 對L e w i s 肺癌在小鼠體內生長的影響．采用小鼠L e w i s 肺癌細胞株( U C ) 于C 5 7 B L ／6 小鼠右前肢腋窩皮下接種，建立C 5 7 B L ／6 小鼠移植瘤模型。小鼠以1 2 小時光照

6、，1 2 小時黑暗交替( L D l 2 ／1 2 ) 提供光源照制2 周。隨機分組，雌雄各半．采用p c D N A 3 ．1 ( + ) 與體內轉染試劑混合物、p c D N A 3 ．1 ( + ) ．m P e r 2 與體內轉染試劑混合物在移植瘤內多點注射．1 0 天后收集標本，采用流式細胞術檢測各組移植瘤細胞的周期及凋亡率，免疫組化法分析P C N A 蛋白表達．結果顯示。p c D N A 3 ．1 ( + ) ．m P

7、e r 2 組瘤重明顯低于p c D N A 3 ．1 ( + ) 對照組，抑瘤率為5 1 ．7 ％．免疫組化結果提示p c D N A 3 ．1 ( + ) ．m P e r 2 組P C N A 表達明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義( P < o ．0 5 ) ．流式細胞檢測表明瘤內注射p c D N A 3 ．1 ( + ) ．m P e r 2 組細胞凋亡率分別是生理鹽水組和空質粒對照組的2 ．5 倍和1 ．9 倍。綜上所