金復(fù)康基于過表達(dá)CXCR4調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肺腺癌淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、目的:本課題在既往研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建小鼠C-X-C型趨化因子受體4(C-X-C chemokinereceptor type4，Cxcr4)基因的慢病毒過表達(dá)載體，經(jīng)體外轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)，并與免疫磁珠法分選獲得小鼠造血干細(xì)胞(Hematopoieticstem cell，HSCs)共移植，重建小鼠骨髓嵌合體模型，探討過表達(dá)CXCR4對MSCs歸巢的影響，以及對整個小鼠骨髓造

2、血系統(tǒng)恢復(fù)的影響。成功造模后，構(gòu)建嵌合體小鼠Lewis肺癌模型，聯(lián)合金復(fù)康口服給藥，探討過表達(dá)CXCR4-MSCs后，腫瘤組織、瘤周組織淋巴管形成情況及腫瘤生長情況，明確金復(fù)康基于過表達(dá)CXCR4調(diào)控淋巴管新生以達(dá)到抗腫瘤作用。
　　方法:(1)觀察小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外不同培養(yǎng)條件下的生長情況，每日細(xì)胞計數(shù)繪制其生長曲線，MTT法測其OD值，流式細(xì)胞術(shù)檢測其純度。(2) CD117+免疫磁珠法分選小鼠骨髓造血干細(xì)胞，流式細(xì)胞

3、術(shù)檢測其分選效率。(3)摸索慢病毒過表達(dá)CXCR4轉(zhuǎn)染MSCs的最佳MOI值，流式細(xì)胞術(shù)檢測其轉(zhuǎn)染效率。(4)以C57BL/6小鼠雄鼠為供體，雌鼠為受體，建立同基因小鼠骨髓嵌合體模型，受鼠接受TBI(總劑量為8Gy，2Gy/min，視野30×30cm)后隨機(jī)分為5組:過表達(dá)CXCR4-MSCs+金復(fù)康組、過表達(dá)CXCR4-MSCs+環(huán)磷酰胺組、過表達(dá)CXCR4-MSCs+生理鹽水組、過表達(dá)空載-MSCs+金復(fù)康組、過表達(dá)空載-MSCs+

4、生理鹽水組。造模成功后，進(jìn)行外周血、骨髓涂片，激光共聚焦顯微鏡下觀察紅色熒光表達(dá)情況，過表達(dá)CXCR4對MSCs歸巢的影響;同時檢測外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板的恢復(fù)情況，觀察其對小鼠骨髓造血系統(tǒng)恢復(fù)的影響。(5)小鼠骨髓嵌合體模型造模成功35天后，于右腋皮下注射Lewis肺癌細(xì)胞（1×107/ml/只），構(gòu)建嵌合體小鼠Lewis肺癌模型，1周后行金復(fù)康灌胃注射（0.4ml/只，相當(dāng)于給藥量60g/kg/d）、環(huán)磷酰胺腹腔注射（20mg

5、/kg/只），生理鹽水灌胃注射（0.4ml/只）。28天后全部處死小鼠，取出腫瘤組織稱重、冰凍切片、免疫熒光染色，淋巴管內(nèi)皮經(jīng)LYVE-1抗體標(biāo)記為綠色，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色，觀察過表達(dá)CXCR4后新生淋巴管中紅色熒光、綠色熒光及Merge后的熒光表達(dá)情況;觀察應(yīng)用金復(fù)康后，腫瘤組織的生長及變化情況。
　　結(jié)果:(1)利用全骨髓培養(yǎng)法可成功獲取高純度的小鼠骨髓MSCs，通過對P3代骨髓MSCs流式鑒定后發(fā)現(xiàn):10％FBS+DM

6、EM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)條件較適宜骨髓MSCs的體外培養(yǎng)，其陽性率分別為CD90.2=42.7％，CD105=98.2％。優(yōu)于10％FBS+DMEM組(CD90.2=19.8％, CD105=95％)和15％FBS+DMEM組(CD90.2=21.3％, CD105=95.7％)。
　　(2) CD117+免疫磁珠法能成功分選出高純度的小鼠骨髓HSCs，流式鑒定結(jié)果顯示，與未分選前相比（陽性率1.1％），利用MACS分選后，可顯

7、著提高其分選效率（陽性率54.5％）。
　　(3)成功將慢病毒過表達(dá)CXCR4轉(zhuǎn)染了P3代MSCs，確定了轉(zhuǎn)染的最佳MOI為40，流式檢測其MSCs上CXCR4含量，與慢病毒NC-MSCs組相比（陽性率12.5％），慢病毒LV-CXCR4-MSCs后，獲得了高轉(zhuǎn)染效率（陽性率71.5％）。(4)成功構(gòu)建了小鼠骨髓嵌合體模型，通過對其外周血、骨髓涂片后發(fā)現(xiàn)，激光共聚焦顯微鏡下觀察到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化、遷移而來的紅色熒光細(xì)胞，且與未

8、過表達(dá)組相比，過表達(dá)組紅色熒光含量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(5)慢病毒過表達(dá)CXCR4后，小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板恢復(fù)明顯增快，與未過表達(dá)組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(6)嵌合體小鼠Lewis肺癌模型構(gòu)建成功后，取出腫瘤稱重統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，慢病毒過表達(dá)CXCR4后，腫瘤組織均明顯增大，與其他各組相比，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而口服應(yīng)用金復(fù)康后腫瘤組織均明顯小于未口服金復(fù)康組，差異

9、具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(7)慢病毒過表達(dá)CXCR4后，新生淋巴管中紅色熒光表達(dá)明顯增多，其中部分新生淋巴管組織可表現(xiàn)為RFP/LYVE-1(GFP)雙陽性。通過計算平均標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化率后發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)各組中平均標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化率明顯高于其他各組(P＜0.05)，而口服金復(fù)康后，金復(fù)康組中平均標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化率顯著低于過表達(dá)組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)體外成功培養(yǎng)出高純度的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并于免疫磁珠法分選獲得的造血干細(xì)胞共移植后

10、，成功構(gòu)建了小鼠骨髓嵌合體模型。(2)慢病毒過表達(dá)CXCR4-MSCs后，可促進(jìn)MSCs的歸巢、同時促進(jìn)了嵌合體小鼠骨髓造血系統(tǒng)的恢復(fù)。(3)慢病毒過表達(dá)CXCR4-MSCs后促進(jìn)了MSCs遷移至肺腫瘤組織且參與了腫瘤組織的淋巴管新生，同時促進(jìn)了腫瘤組織的生長。(4)金復(fù)康口服液對Lewis肺腫瘤組織生長具有明顯抑制作用，其機(jī)制可能是通過抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而達(dá)到抗腫瘤作用，而SDF-1/CXCR4可能是其通路之一。