米諾環(huán)素對大鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護及對GDNF和VEGF表達的影響.pdf

1、目的:視神經(jīng)損傷是臨床常見的眼外傷類型，可以導致嚴重的視力障礙甚至視力完全喪失，是眼科領域亟待解決的難題。既往認為視神經(jīng)損傷后無再生能力，而近年來研究顯示，約有50％視神經(jīng)損傷患者能不同程度的恢復視力，表明視神經(jīng)損傷后在一定條件下可以再生。因此，尋找一種安全有效的藥物以延緩視神經(jīng)損害病變的發(fā)展迫在眉睫。米諾環(huán)素是一種第二代半合成四環(huán)素類抗生素，近年研究顯示，米諾環(huán)素(Minocycline，MC)對受損的神經(jīng)元有相當強的保護作用。人們對

2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，其在神經(jīng)系統(tǒng)的變性等疾病中具有抗炎、抗凋亡等作用，能夠通過抑制小膠質(zhì)細胞及前凋亡因子，拮抗谷氨酸的神經(jīng)毒性作用，從而提高神經(jīng)元的生存率，發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。動物模型研究表明，米諾環(huán)素在腦中可達50％的血藥峰濃度，因此在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦缺血、腦外傷、萎縮性脊髓側索硬化、亨廷頓病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜疾病動模型中均顯示有一定的神經(jīng)元保護作用。而且經(jīng)實踐證明，長期口服米諾環(huán)素無明顯不良反應、安全有效。

3、雖然米諾環(huán)素用在中樞神經(jīng)保護方面的研究日漸增加，但在視神經(jīng)損傷后，米諾環(huán)素能否發(fā)揮一定的神經(jīng)保護作用及作用機制尚不清楚，且在眼科視神經(jīng)保護方面的報道少見。
　　 本實驗通過采用視神經(jīng)夾傷模型建立大鼠視神經(jīng)損傷模型，并加以腹腔注射一定劑量的米諾環(huán)素進行干預，應用計算機圖像分析技術和免疫組化技術對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)

4、及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達進行半定量測定，探討米諾環(huán)素對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用，從而為臨床治療視神經(jīng)損傷提供實驗依據(jù)。
　　 方法:選用健康清潔級雄性SD大鼠50只（由河北醫(yī)科大學實驗動物研究中心提供），體質(zhì)量(200±20)g，適應性喂養(yǎng)5d后查雙眼，屈光間質(zhì)清，瞳孔等大、等圓，對光反射靈敏，眼底無異常者入組，隨機分為三組:空白對照組10只，生

5、理鹽水對照組20只，米諾環(huán)素治療組20只。兩實驗組均采用視神經(jīng)鉗夾法將左眼制成視神經(jīng)損傷模型，右眼為自身對照眼，之后行直接檢眼鏡檢查，眼底紅光反射正常，無缺血，無眼球突出，眼瞼閉合完全者為成功模型，右眼不予處理。
　　 實驗動物10％水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉并經(jīng)常規(guī)無菌處理后，沿角鞏膜緣環(huán)形剪開顳側球結膜，鈍性分離暴露視神經(jīng)眶內(nèi)段，用標定力量的反向鑷于球后2mm處鉗夾視神經(jīng)，致傷時間為20s，用10-0尼龍線縫合球

6、結膜2針，結膜囊內(nèi)涂氧氟沙星眼膏。米諾環(huán)素組、生理鹽水組于視神經(jīng)夾傷前1h及夾傷后每天腹腔分別注射米諾環(huán)素45mg/kg、等容量生理鹽水，空白對照組無特殊處理。
　　 分別于傷后1天、3天、7天、14天、28天多聚甲醛心臟灌注處死大鼠，立即摘除左眼眼球，鋸齒緣后0.5mm處剪開眼球壁，去除眼前節(jié)和玻璃體。用體積分數(shù)為4％的多聚甲醛進行固定，4℃冰箱過夜，眼杯行全層石蠟包埋，制備5～7μm視網(wǎng)膜切片，顯微鏡觀察并同步采集圖像。

7、r>　　 常規(guī)HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學變化，并應用圖像分析系統(tǒng)(×400)對結果進行分析（每張切片取4個視野，在距離視乳頭中心1.5mm處視網(wǎng)膜為觀察始點分別向四面各取1個視野，每個眼球取2張切片）。GDNF的檢測采用免疫組化半定量的方法，計算機圖像分析，并用多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)對視網(wǎng)膜中陽性反應部位進行分析，得出平均光密度值。
　　 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，平均光密度值及平均陽性細胞數(shù)結果均以(x)±s表示

8、，同一組內(nèi)不同時間點數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-wayANOVA)，不同組間同一時間點數(shù)據(jù)進行兩樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞蘇木精-伊紅染色結果:
　　 1.1、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)學改變:空白對照組大鼠視網(wǎng)膜大致呈3層平行排列，分為神經(jīng)節(jié)細胞層、雙極細胞層及感光細胞層，視網(wǎng)膜節(jié)細胞位于視網(wǎng)膜內(nèi)層，單層排列，細胞比較

9、致密，細胞核排列均勻整齊。生理鹽水對照組可見隨著損傷時間延長，大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層胞核排列明顯紊亂，空泡化程度增強，雙極細胞層胞核數(shù)量也不同程度減少。比較而言，相同時間點米諾環(huán)素治療組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞排列相對整齊，空泡化程度相對較弱，雙極細胞層飽和數(shù)量相對較多。
　　 1.2、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量改變:正常對照組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)為29.9±0.10。生理鹽水對照組大鼠1天、3天、7天、14天、28天光鏡下每×400視野

10、平均視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目分別為:23.6±2.07個、18.2±0.84個、12.2±1.30個、7.4±2.19個、3.6±1.51個，米諾環(huán)素治療組大鼠1天、3天、7天、14天、28天光鏡下每×400視野平均視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目分別為:26.4±2.07個、21.8±2.59個、15.4±1.14個、11.8±1.64個、7.6±1.81個，相同時間點治療組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量均高于對照組，3天時間點視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學

11、意義(P＜0.05)，7天、14天、28天時間點視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 2、視網(wǎng)膜GDNF和VEGF免疫組化半定量檢測結果:
　　 2.1、GDNF在視網(wǎng)膜中的表達:大鼠視網(wǎng)膜中GDNF主要在各層細胞胞體表達，呈棕黃色，正常對照組視網(wǎng)膜組織中GDNF弱陽性表達，平均光密度值為0.1543±0.0060，各時間點無變化。生理鹽水對照組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層GDNF表達平均光密度值1天、

12、3天、7天、14天、28天的值分另為:0.2323±0.0024、0.2804±0.0040、0.2962±0.0022、0.3401±0.0021、0.2830±0.0027，米諾環(huán)素治療組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層GDNF表達平均光密度值1天、3天、7天、14天、28天的值分別為:0.2348±0.0036、0.2870±0.0041、0.3016±0.0022、0.3506±0.0060、0.2882±0.0023，視神經(jīng)夾傷后兩實驗組均

13、有GDNF陽性表達，生理鹽水對照組表現(xiàn)為弱陽性;米諾環(huán)素治療組GDNF表達呈上升趨勢，14天后表達呈強陽性;生理鹽水對照組表達也隨時間有所增強，但14天時表達較治療組仍不明顯;相同時間點治療組GDNF陽性率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2.2、VEGF在視網(wǎng)膜中的表達:大鼠視網(wǎng)膜中VEGF主要在各層細胞胞體、胞漿表達，呈棕黃色。正常對照組視網(wǎng)膜組織中VEGF弱陽性表達，平均光密度值為0.1598±0.

14、0055，各時間點無變化。生理鹽水對照組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層VEGF表達平均光密度值1天、3天、7天、14天、28天的值分別為:0.2266±0.0013，0.2276±0.0011，0.2909±0.0044，0.3209±0.0033，0.3427±0.0011;米諾環(huán)素治療組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層VEGF表達的平均光密度值1天、3天、7天、14天、28天的值分別為:0.2271±0.0017,0.2287±0.0007,0.3090±0

15、.0105,0.3256±0.0021,0.3488±0.0010。米諾環(huán)素治療組及生理鹽水對照組VEGF表達均呈上升趨勢，第1、3、7天時間點生理鹽水對照組較米諾環(huán)素治療組平均光密度值數(shù)值比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，從第14天開始米諾環(huán)素治療組VEGF表達的平均光密度值較生理鹽水對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），28天時間點時，血管內(nèi)皮生長因子表達的平均光密度值較生理鹽水對照組高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。