miRNAs在變性真皮及熱損傷成纖維細(xì)胞-HUVECs中表達(dá)及功能的研究.pdf

1、目的：
　　采用基因芯片的方法篩選燒傷患者變性真皮較正常皮膚中差異表達(dá)的miRNAs，然后預(yù)測其靶基因以及對變性真皮可能起保護(hù)作用的信號通路;挑選出在細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用的miR-199a-5p及miR-126，檢測其在大鼠變性真皮中的表達(dá)規(guī)律;深入研究miR-199a-5p在熱損傷成纖維細(xì)胞、miR-126在熱損傷人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）轉(zhuǎn)歸中的作用，并探討其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1.收集

2、深二度燒傷患者的變性真皮及配對正常皮膚，標(biāo)本收集時間均為患者燒傷后第四天，采用高通量miRNA芯片技術(shù)初步篩選出變性真皮較正常皮膚差異表達(dá)的miRNAs。在另一組標(biāo)本中應(yīng)用QRT-PCR技術(shù)檢測部分差異表達(dá)的miRNAs，驗證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用生物信息學(xué)方法預(yù)測其靶基因以及對變性真皮可能起保護(hù)作用的信號通路。篩選出與芯片結(jié)果一致并且在細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用的miRNAs（miR-199a-5p和miR-126）進(jìn)行下一步實驗。

3、
　　2.建立大鼠深二度燙傷模型，檢測miR-199a-5p和miR-126在大鼠變性真皮恢復(fù)不同時間（燙傷后1天、3天、5天、7天、14天）的表達(dá)情況，以大鼠正常皮膚做為對照。
　　3.建立成纖維細(xì)胞熱損傷模型(52°，30s)，應(yīng)用QRT-PCR技術(shù)檢測miR-199a-5p在成纖維細(xì)胞熱損傷后恢復(fù)不同時間(損傷2h、24h、48h)的表達(dá)情況，以正常成纖維細(xì)胞做為對照。成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-199a-5p模擬物和抑制物

4、后進(jìn)行熱損傷預(yù)處理，采用MTT法、細(xì)胞劃痕試驗及Transwell實驗檢測miR-199a-5p對熱損傷成纖維細(xì)胞增殖遷移能力的影響。
　　4.建立HUVECs熱損傷模型(52°，30s)，應(yīng)用QRT-PCR技術(shù)檢測miR-126在HUVECs熱損傷后恢復(fù)不同時間（損傷2h、12h、24h）的表達(dá)情況，以正常HUVECs做為對照。HUVECs轉(zhuǎn)染miR-126模擬物和抑制物后進(jìn)行熱損傷預(yù)處理，采用MTT法、細(xì)胞劃痕試驗及Trans

5、well實驗檢測miR-126對熱損傷HUVECs增殖遷移能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，燒傷患者的變性真皮相對正常皮膚差異表達(dá)的miRNAs有66個，其中34個顯著下調(diào)，32個顯著上調(diào)，上調(diào)比較明顯的有miR-223、miR-320c，下調(diào)比較明顯的是miR-203、miR-126、miR-199a-5p。通過生物信息學(xué)方法對差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)16個與創(chuàng)面修復(fù)密切相關(guān)的信號通路

6、(如Apoptosis、Calciumsignalingpathway、Celladhesionmolecules、Cellcycle)，它們可能在變性真皮轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。
　　2.動物實驗結(jié)果顯示:miR-199a-5p在大鼠變性真皮中早期呈低表達(dá)，3天降低最明顯，之后不斷升高，于第7天基本恢復(fù)正常;miR-126在大鼠變性真皮中也明顯低表達(dá)，但于第5天基本恢復(fù)正常，之后繼續(xù)升高，第14天增高為正常皮膚的5倍。
　　3

7、.成纖維細(xì)胞熱熱損傷后24小時miR-199a-5p的表達(dá)量降低為正常成纖維細(xì)胞的10％，于48小時基本恢復(fù)正常。成纖維細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-199a-5p模擬物和抑制物后進(jìn)行熱損傷預(yù)處理，MTT結(jié)果顯示:與對照組相比，miRNA-199a-5p抑制物組的細(xì)胞生長明顯較快(P＜0.05)，在熱損傷后48小時、72小時表現(xiàn)均明顯;細(xì)胞劃痕實驗顯示:miRNA-199a-5p抑制物組的細(xì)胞遷移較快，遷移距離較遠(yuǎn)(P＜0.05);transwe

8、ll實驗結(jié)果顯示:miRNA-199a-5p抑制物組的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯高于對照組(P＜0.05)。而miRNA-199a-5p模擬物組各項實驗數(shù)據(jù)與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4.HUVECs熱損傷后2小時miR-126的表達(dá)量降到正常HUVECs的40％，但是12小時便升高到正常HUVECs的2倍，24小時達(dá)到正常HUVECs組的7倍。HUVECs轉(zhuǎn)染miR-126模擬物和抑制物后進(jìn)行熱損傷預(yù)處理，MTT結(jié)果顯示:

9、與對照組相比，miRNA-126模擬物組細(xì)胞的生長明顯較快，尤其在24小時、48小時表現(xiàn)明顯(P＜0.05);細(xì)胞劃痕實驗顯示:miRNA-126模擬物組細(xì)胞遷移較快，遷移距離較遠(yuǎn);transwell實驗結(jié)果顯示:miRNA-126模擬物組細(xì)胞遷移數(shù)量明顯多于對照組(P＜0.05)。而miRNA-199a-5p抑制物組實驗數(shù)據(jù)與對照組無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.篩選出燒傷患者變性真皮較正常皮膚差異表達(dá)的

10、miRNAs，并預(yù)測出Apoptosis、Calciumsignalingpathway、Celladhesionmolecules、Cellcycle等16個對變性真皮可能起保護(hù)作用的信號通路，為進(jìn)一步探討變性真皮轉(zhuǎn)歸的機(jī)制提供了新的思路。
　　2.miR-199a-5p和miR-126在大鼠變性真皮中的表達(dá)均呈時間依賴性改變。損傷早期miR-199a-5p和miR-126均表達(dá)下降、然后逐漸恢復(fù)正常，不同的是損傷后期miR-1