腫瘤抑制蛋白ARF的一個(gè)新結(jié)合蛋白NMI的發(fā)現(xiàn)及其調(diào)控ARF蛋白穩(wěn)定性的研究.pdf

1、ARF是一個(gè)重要的腫瘤抑制蛋白，編碼ARF的INK4a/ARF基因位點(diǎn)位于人類染色體9p21區(qū)域。INK4a/ARF基因位點(diǎn)的缺失是人類腫瘤發(fā)生過程中最經(jīng)常發(fā)生的事件之一，其在大約40％的人類腫瘤中發(fā)生了缺失和突變，包括惡性黑色素瘤、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、某些類型的白血病、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和膀胱癌。而在結(jié)腸癌中，在表觀遺傳水平上ARF基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)則發(fā)生了甲基化修飾被沉默。因此，ARF的失活和突變?cè)谀[瘤的發(fā)生中具有重要作用。

2、　　 ARF被廣泛認(rèn)為的最重要的一個(gè)功能是參與癌基因誘導(dǎo)的Mdm2/p53依賴性細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的調(diào)控。在癌基因活化時(shí)，ARF通過激活p53而抑制癌基因造成的細(xì)胞過度增殖。在正常情況下，ARF的表達(dá)量非常低;但當(dāng)細(xì)胞中癌基因活化時(shí)，ARF就被誘導(dǎo)表達(dá)。Mdm2是p53的主要負(fù)調(diào)控蛋白，ARF通過抑制Mdm2(在人類中為Hdm2)的功能，引起p53依賴的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。ARF與Mdm2直接結(jié)合，從而阻礙Mdm2介導(dǎo)的p53泛素化、

3、核輸出、以及隨后的降解。同時(shí)，ARF也被認(rèn)為可以通過將Mdm2束縛在核仁中而穩(wěn)定核漿中的p53。另外，ARF也可以通過抑制最近發(fā)現(xiàn)的E3泛素化連接酶ARF-BPl/Mule對(duì)p53的泛素化降解，而穩(wěn)定p53。除此之外，ARF還通過p53非依賴性途徑發(fā)揮腫瘤抑制功能，如ARF可以與E2F1，c-Myc，NPM/B23，Tip60等蛋白相互作用并調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路。
　　 除了參與癌基因活化的感應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)ARF還參與另外一個(gè)重要的

4、細(xì)胞檢控點(diǎn)---DNA損傷檢控點(diǎn)（DNAdamagecheckpoint）的調(diào)控。
　　 但在ARF功能與調(diào)控的研究方面仍有許多問題不清楚。其中一個(gè)重要的沒有解決的問題是:ARF如何感應(yīng)癌基因活化和DNA損傷，即癌基因活化和DNA損傷誘導(dǎo)ARF的機(jī)制是什么。mRNA的轉(zhuǎn)錄可能在某些情況下調(diào)控ARF的表達(dá);但蛋白翻譯后修飾在ARF的誘導(dǎo)表達(dá)中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。這方面的研究雖然取得了一些積極進(jìn)展，但仍存在許多問題。為了深入研究ARF的

5、功能和調(diào)控，本論文工作利用酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的ARF結(jié)合蛋白NMI，并對(duì)NMI調(diào)控ARF的功能進(jìn)行了研究。
　　 首先，本論文工作在293T細(xì)胞過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了NMI與ARF的結(jié)合。接著利用GST-pulldown體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了NMI與ARF存在直接結(jié)合。為了研究NMI對(duì)ARF的調(diào)控，我們構(gòu)建了H1299-NMI細(xì)胞系。有趣的是，在H1299-NMI細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)ARF的表達(dá)水平顯著升高。實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)

6、揭示ARFmRNA水平并沒有發(fā)生變化，因此暗示NMI可能調(diào)控ARF蛋白的穩(wěn)定性。接下來，在p53缺失的H1299非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和p53野生的人骨肉瘤U2OS細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染NMI都可以引起內(nèi)源性ARF蛋白的水平上升，這同時(shí)說明了NMI對(duì)ARF的誘導(dǎo)是p53非依賴性的。通過測(cè)定蛋白半衰期，發(fā)現(xiàn)NMI的確增強(qiáng)了ARF蛋白的穩(wěn)定性。為了深入研究NMI如何調(diào)控ARF蛋白的穩(wěn)定性，本論文工作在機(jī)理方面進(jìn)行了探索。我們發(fā)現(xiàn)NMI通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ARF的

7、E3泛素化連接酶ULF，抑制ULF對(duì)ARF的泛素化修飾，增強(qiáng)ARF蛋白的穩(wěn)定性。這些是ARF誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)理研究方面的新發(fā)現(xiàn)。本論文工作進(jìn)一步對(duì)NMI調(diào)控ARF的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)癌基因（如c-Myc、E2F1）活化、DNA損傷和IFNα刺激等細(xì)胞脅迫引起NMI水平升高，并伴隨ARF的誘導(dǎo)表達(dá)。并且，在MMS處理和IFNα刺激時(shí)，NMI能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中與ARF結(jié)合，可能通過向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)現(xiàn)對(duì)ARF誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控作用。利用s

8、hRNA降低NMI的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMS處理和IFNα刺激誘導(dǎo)的ARF表達(dá)受到了很大程度的抑制。最后，通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，本論文工作證實(shí)細(xì)胞脅迫刺激通過NMI和ARF激活了ATM/Chk2信號(hào)通路，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，引起細(xì)胞增殖的抑制，這些結(jié)果說明了NMI可能在細(xì)胞脅迫時(shí)ARF的誘導(dǎo)表達(dá)中發(fā)揮重要作用。NMI可能在蛋白翻譯后泛素化修飾方面通過ULF調(diào)控ARF的水平。利用這種機(jī)制，NMI參與了DNA損傷或癌