TLR4及其相關(guān)信號(hào)通路在自身免疫性糖尿病中的作用機(jī)制探討與藥物干預(yù).pdf

1、第一部分：TLR4信號(hào)通路對(duì)NOD小鼠自身免疫性糖尿病發(fā)病的影響
　　實(shí)驗(yàn)背景：
　　目前臨床上尚無(wú)自身免疫性糖尿病(Autoimmune diabetes),又稱(chēng)1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)的有效治療手段。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,感染是T1DM發(fā)病的誘因之一。但近年來(lái),基于衛(wèi)生假說(shuō)的提出,動(dòng)物和臨床研究均顯示,適當(dāng)?shù)母腥緦?duì)包括T1DM在內(nèi)的自身免疫性疾病發(fā)病具有抑制作用,其具體機(jī)制尚不清楚

2、。而作為來(lái)源于革蘭氏陰性菌脂多糖(Lipopolysaccharid,LPS)的受體,Toll-like receptor(TLR)4在T1DM中的作用引起了人們的關(guān)注。我們?cè)O(shè)想,LPS對(duì)TLR4信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用可能參與其對(duì)T1DM發(fā)病的干預(yù)。
　　目的：
　　研究LPS干預(yù)對(duì)非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)鼠自發(fā)性自身免疫性糖尿病發(fā)展的影響及其可能機(jī)制,重點(diǎn)觀察TLR4表達(dá)的變化,探討TLR4

3、在LPS對(duì)T1DM干預(yù)效應(yīng)中的作用。
　　方法：
　　7-8周齡雌性NOD小鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組、LPS單次干預(yù)組、LPS多次干預(yù)組,每組20只。LPS單次干預(yù)組于NOD小鼠7-8周齡腹腔注射LPS10μg/只,之后每周腹腔注射生理鹽水0.2ml/只,連續(xù)3周;LPS多次干預(yù)組于7-8周齡開(kāi)始,每周每只NOD小鼠腹腔注射10μgLPS,連續(xù)4周;對(duì)照組于7-8周齡開(kāi)始,每周腹腔注射生理鹽水0.2ml/只,連續(xù)4周。于最后一

4、次干預(yù)后,每組隨機(jī)選取8只11-12周齡NOD小鼠行腹腔內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn)、取血清測(cè)定細(xì)胞因子水平、處死后取胰腺、胸腺及脾臟,行胰腺病理組織學(xué)檢查、分離脾臟淋巴細(xì)胞,測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)比例、分離骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)并測(cè)定其表型、同時(shí)測(cè)定胰腺、胸腺、脾臟組織及DCTLR4表達(dá)。每組剩余動(dòng)物繼續(xù)飼養(yǎng)至26-

5、27周齡,每周2次尾靜脈取血,測(cè)定血糖了解糖尿病發(fā)病情況。
　　結(jié)果：
　　LPS多次干預(yù)能夠改善11-12周齡NOD鼠糖耐量并顯著降低糖尿病發(fā)病率;LPS單次干預(yù)組僅能改善糖耐量。LPS干預(yù)不保護(hù)或逆轉(zhuǎn)NOD小鼠胰島炎,也不影響胰島數(shù)目,對(duì)Th2型細(xì)胞因子水平、DC表型以及脾臟TLR4表達(dá)均無(wú)顯著影響,但能抑制Th1型細(xì)胞因子生成及脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+Treg分化、并顯著下調(diào)胸腺、DC以及

6、胰腺TLR4表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　LPS干預(yù)(特別是多次干預(yù))通過(guò)延緩胰島炎向糖尿病發(fā)病的惡化過(guò)程發(fā)揮T1DM保護(hù)作用。其保護(hù)機(jī)制可能與兩種重要的免疫耐受相關(guān)細(xì)胞Treg和DC有關(guān)-一方面LPS促進(jìn)Treg分化,促進(jìn)免疫耐受的形成;另一方面通過(guò)下調(diào)DCTLR4表達(dá),控制LPS信號(hào)通路的活化,而對(duì)抗DC的致免疫作用。
　　第二部分：紅活麻總香豆素通過(guò)下調(diào)TLR4信號(hào)通路發(fā)揮自身免疫性糖尿病保護(hù)作用
　　實(shí)驗(yàn)背景：

7、
　　民族藥紅活麻(Urtica dentata Hand,UDH)為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻(Laportea bulbifera(Sieb.et.Zucc.)Wedd)的干燥根,因具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,在以類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎為代表的自身免疫性疾病治療方面的應(yīng)用由來(lái)已久,其主要活性成分為香豆素類(lèi)。
　　目的：
　　研究紅活麻總香豆素(Total coumarins,TC)對(duì)自身免疫性糖尿病發(fā)病的影響。
　　方法：<

8、br>　　8周齡雌性NOD小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、TC低、中、高劑量組。給藥低、中、高劑量組分別以37.5、75和150mg/kgTC隔日灌胃給藥,對(duì)照組同法給予等容積生理鹽水,連續(xù)4周,每組20只。于最后一次給藥后,每組隨機(jī)選取8只12周齡NOD小鼠行腹腔內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn),取血清測(cè)定細(xì)胞因子水平,處死后取胰腺、胸腺及脾臟,行胰腺病理組織學(xué)檢查、分離脾臟淋巴細(xì)胞,測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例、分離

9、骨髓來(lái)源DC并測(cè)定其表型、測(cè)定胸腺、脾臟組織Foxp3表達(dá)、胰腺、胸腺、脾臟組織及DCTLR4表達(dá)、并檢測(cè)TLR4相關(guān)信號(hào)分子mRNA表達(dá)。每組剩余動(dòng)物繼續(xù)飼養(yǎng)至26周齡,每周2次尾靜脈取血,測(cè)定血糖了解糖尿病發(fā)病情況。
　　結(jié)果：
　　與對(duì)照組相比,TC連續(xù)給藥4周能夠改善NOD鼠胰島炎癥、提高糖耐量并顯著降低糖尿病發(fā)病率。TC可抑制脾T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、誘導(dǎo)Th2偏向性細(xì)胞因子反應(yīng)、促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+Tr

10、eg分化和Foxp3mRNA表達(dá)。TC給藥組DC表型呈現(xiàn)MHC-II和CD86分子低表達(dá)狀態(tài)。此外,TC給藥組胰腺、胸腺、脾臟組織及DCTLR4表達(dá)顯著下調(diào)。TLR4下游關(guān)鍵分子髓樣分化因子(myeloid differentiation factor,MyD)88、核因子(nuclear factor,NF)-κB,IL-1β,干擾素β誘導(dǎo)性toll–IL-1受體相關(guān)銜接蛋白(Toll–IL-1 receptor domain-con

11、taining adaptor inducing interferon-β,TRIF),TRIF相關(guān)銜接分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM),干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor,IRF)-3及IFN-β在TC給藥組均顯著下調(diào),提示TC對(duì)TLR4下游MyD88依賴(lài)性和非依賴(lài)性信號(hào)通路均有抑制作用。
　　結(jié)論：
　　TC通過(guò)下調(diào)TLR4信號(hào)通路發(fā)揮自身

12、免疫性糖尿病保護(hù)作用。
　　第三部分：Kv1.3相關(guān)DCTLR4信號(hào)通路的體外研究與藥物干預(yù)
　　實(shí)驗(yàn)背景：
　　DC表面TLR4在調(diào)控DC致免疫和致耐受作用中的作用至關(guān)重要。而Shaker相關(guān)電壓門(mén)控Kv1.3(KCNA3)在DC功能調(diào)控方面也具有重要作用。公認(rèn)的TLR4配體LPS刺激DC成熟的過(guò)程中伴有Kv1.3的上調(diào),而Kv1.3抑制劑能夠抵消LPS的刺激作用。
　　目的：
　　利用小鼠DC2.4細(xì)胞

13、系,體外研究TLR4與Kv1.3的相互作用,并在此基礎(chǔ)上研究紅活麻總香豆素對(duì)DCTLR4/Kv1.3信號(hào)通路的影響。
　　方法：
　　對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DC2.4細(xì)胞分為4組:LPS處理組、LPS+TC處理組、LPS+Kv1.3抑制劑處理組及空白組,FACS法測(cè)定各組DC上MHC-II表達(dá),Western blot法測(cè)定DCTLR4及Kv1.3表達(dá)水平的改變。
　　結(jié)果：
　　DC2.4細(xì)胞結(jié)構(gòu)性表達(dá)TLR4及Kv1.3

14、,而LPS能夠顯著誘導(dǎo)二者在DC上的表達(dá)。Kv1.3抑制劑能夠顯著抑制Kv1.3的蛋白表達(dá),并顯著對(duì)抗TLR4配體LPS誘導(dǎo)的DC上MHC-II的上調(diào),但對(duì)LPS誘導(dǎo)的DCTLR4表達(dá)水平并無(wú)顯著影響。體外給予50μg/ml紅活麻總香豆素能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的DC上MHC-II、TLR4及Kv1.3表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　Kv1.3與DCTLR4信號(hào)通路相關(guān);Kv1.3也參與紅活麻總香豆素對(duì)DCTLR4信號(hào)通路的干預(yù)過(guò)程。