TLR4在1型糖尿病腎病及TLR3在自身免疫性肝炎中作用的研究.pdf

1、第一部分細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)及TLR4在NOD小鼠糖尿病早期腎病模型中作用的研究
　　 糖尿病腎病是年輕人終末期腎病的主要因?yàn)?40％的長(zhǎng)期1型糖尿病患者最后會(huì)進(jìn)展成糖尿病腎病。當(dāng)前的治療,包括降糖、降壓、改善高脂血癥都會(huì)延緩糖尿病腎病的進(jìn)展,但最終還是會(huì)有一部分糖尿病患者最后發(fā)展為慢性腎衰竭。因此,最大限度地發(fā)揮當(dāng)前治療的效應(yīng),以及確立新的治療策略和找出其他的治療靶點(diǎn)在糖尿病腎病治療中顯得尤為重要。
　　 很多因素參

2、與了糖尿病腎病的進(jìn)展。代謝性因素,例如糖基化終末產(chǎn)物的形成和多羥基產(chǎn)物的增加都參與了糖尿病腎病。很多生長(zhǎng)因子也在糖尿病腎病中起到了一定作用。雖然糖尿病腎病不是主要由免疫反應(yīng)介導(dǎo),然而在1型糖尿病病人腎臟活檢中發(fā)現(xiàn)了球旁器中T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。此外,在1型和2型糖尿病腎病患者腎活檢切片中都發(fā)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。基于這些發(fā)現(xiàn),探討免疫系統(tǒng)在糖尿病腎病中的作用就尤為重要。
　　 TLR在天然性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中都發(fā)揮了非常重要的作用

3、。TLR4主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面,同時(shí)也表達(dá)在氣道上皮、脂肪組織、骨骼肌、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等組織細(xì)胞,是革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖的主要受體。同時(shí)TLR4也可以結(jié)合包括熱休克蛋白、纖維粘素、纖維原、游離脂肪酸、飽和脂肪酸在內(nèi)的內(nèi)源性配體。TLR4激活后可以產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子。近年的研究表明1型糖尿病患者外周血單核細(xì)胞表面上的TLR2和TLR4表達(dá)增加。TLR4在1型糖尿病的發(fā)病、肥胖和2型糖尿病的胰島素抵抗中都起到重要作用。<

4、br>　　 研究目的
　　 1.在這項(xiàng)研究中,利用非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠,建立1型糖尿病模型和糖尿病腎病模型。
　　 2.利用這個(gè)模型,探討NOD小鼠糖尿病腎病免疫病理的改變。
　　 3.探討細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)在糖尿病腎病不同發(fā)病病程中的作用。
　　 4.利用TLR4基因敲除(TLR4-/-NOD)小鼠,探討TLR4在1型糖尿病早期腎病中的作用。
　　 材料與方法
　　 1

5、.動(dòng)物:雌性NOD/Caj小鼠以及TLR4-/-NOD小鼠
　　 2.糖尿病模型和糖尿病腎病模型的建立:通過篩查尿糖以及測(cè)定血糖水平來明確糖尿病,通過篩查尿蛋白以及24小時(shí)尿蛋白定量來確定糖尿病腎病。
　　 3.組織學(xué)染色:灌注腎臟,4％的多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片后進(jìn)行過碘酸.雪夫(PAS)染色確定腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。
　　 4.免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡檢查:腎臟灌注后放入高碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定

6、液中(PLP)固定,速凍切片后,加入一抗和二抗進(jìn)行染色,共聚焦顯微鏡觀察。
　　 5.電子顯微鏡檢查:投射電鏡觀察腎小球形態(tài),免疫金顆粒標(biāo)記進(jìn)一步證實(shí)免疫球蛋白的沉積和沉積位置。
　　 6.RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù):TRIzol從小鼠腎臟組織中分離出總的RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行引物設(shè)計(jì)后,實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 7.抗胰島素自身抗體的確定。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用Grap

7、hPad Prism4.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果
　　 在糖尿病小鼠的腎小球中有T和B淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn),同時(shí)有CD11c陽性的樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn),這些CD11c陽性的樹突狀細(xì)胞和CD4和CD8陽性的T細(xì)胞有著緊密的接觸。在糖尿病小鼠的腎小球中有免疫球蛋白Ig的沉積,同時(shí)伴有補(bǔ)體C3的沉積。另外,糖尿病小鼠的血清中含有自身抗體,這些自身抗體能夠和正常小鼠的腎小球某些成分起反應(yīng),而正常不患病的小鼠血清就不能出現(xiàn)這種反應(yīng)。

8、隨著糖尿病病程的進(jìn)展,腎臟中免疫改變的出現(xiàn)同時(shí)伴隨著腎臟的增大和尿白蛋白排泄的增加。TLR4-/-的糖尿病小鼠腎臟組織中也觀察到Ig和補(bǔ)體C3的沉積,但比在野生型的糖尿病NOD小鼠腎臟中的沉積減輕。
　　 結(jié)論
　　 1.淋巴細(xì)胞和自身抗體參與了1型糖尿病腎病。
　　 2.TLR4基因敲除后可以減輕患糖尿病小鼠腎臟中的Ig和補(bǔ)體C3的沉積,表明TLR4在糖尿病早期腎病中起到一定的作用。
　　 3.深刻了解

9、免疫系統(tǒng)在糖尿病腎病中的作用可以更好地確立新的糖尿病治療方案,對(duì)糖尿病腎病的預(yù)防起到積極的作用。
　　 第二部分
　　 急性肝炎中TLR3的炎性調(diào)節(jié)研究
　　 背景
　　 TLR通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)對(duì)外界致病原進(jìn)行防御,除了在天然性免疫系統(tǒng)中的重要作用,TLR在炎癥調(diào)節(jié)中包括各種無菌性炎癥,例如損傷和傷口愈合中也起到了主要作用。TLR在炎癥調(diào)節(jié)中的作用部分取決于TLR可以識(shí)別一些被稱做

10、損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)的內(nèi)源性配體。肝臟不但是代表許多疾病致病細(xì)菌PAMPs的主要靶點(diǎn),而且也是損傷后DAMPs上調(diào)的主要器官。
　　 研究表明TLR3能夠?qū)碜圆《镜碾p鏈RNA(dsRNA)、來自凋亡或壞死細(xì)胞的雙鏈RNA產(chǎn)生反應(yīng)。死亡的細(xì)胞中含有豐富的可以激活TLR(包括TLR3)的各種配體。表達(dá)在肝臟中的TLR3很可能是激活天然性免疫和炎癥反應(yīng)的一個(gè)介導(dǎo)者。TLR3在急性肝炎中的這些重要作用在以前的研究中沒有被詳細(xì)

11、探討過。
　　 研究目的
　　 1.建立Con A誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型,模擬人類急性爆發(fā)性肝炎。
　　 2.探討了TLR3在沒有外源性病毒激活的情況下,在Con A誘導(dǎo)的肝炎中對(duì)肝細(xì)胞損害的作用。
　　 材料與方法
　　 1.動(dòng)物:NOD/Caj小鼠,C57BL/6(B6)小鼠,TLR3-/-NOD小鼠,TLR3-/-B6小鼠。
　　 2.肝炎的誘導(dǎo):ConA被溶于無菌的PBS中,以15mg

12、/kg的劑量靜脈注射給小鼠。ConA注射后0、8、24小時(shí)給小鼠取血。對(duì)照組小鼠注射等劑量的PBS。注射24小時(shí)后小鼠被處死。
　　 3.肝功能的評(píng)價(jià):血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶用試劑盒測(cè)定。
　　 4.肝臟單個(gè)核細(xì)胞的分離:灌注的肝臟通過200-gauge的不銹鋼網(wǎng)后,細(xì)胞被懸浮在30％的percoll中,70％percoll被輕輕地打到懸浮液底。密度梯度離心后,收集中間層為肝臟單個(gè)核細(xì)胞,PBS洗一遍。
　　 5.

13、流式細(xì)胞儀分析:除非特別標(biāo)明,所有用于流式細(xì)胞儀分析的抗體購于eBioscience。Fc receptor封閉后,用特定的結(jié)合不同熒光素的單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記；細(xì)胞首先被固定,透化處理后,用Cytofix/Cytoperm試劑盒進(jìn)行染色分析細(xì)胞內(nèi)蛋白；用FACSCalibur的流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞,結(jié)果用Flowjo軟件分析。
　　 6.組織學(xué)檢查和免疫染色:按照常規(guī)方法對(duì)肝臟組織進(jìn)行H&E染色。灌注過的肝臟組織被放在高碘

14、酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液中(PLP)中過夜固定,用OCTTissue-Tek包埋,然后速凍,切成10μm的切片,2％的山羊血清封閉,加入一抗和二抗進(jìn)行免疫熒光染色,用META510共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。
　　 7.肝臟細(xì)胞凋亡分析:肝細(xì)胞核DNA雙鏈斷裂用TUNEL試劑盒分析。
　　 8.血清細(xì)胞因子測(cè)定:血清中IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-17用Luminex測(cè)定。IFN-α的水平用ELISA試劑盒按

15、照操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。
　　 9.骨髓嵌合體小鼠的生成:通過PBS灌洗小鼠脛骨和腓骨,分別從WT和TLR3-/-供體小鼠獲得骨髓細(xì)胞。接受骨髓移植的受體小鼠進(jìn)行照射后,將供體骨髓細(xì)胞注射到被照射的小鼠中,建立骨髓嵌合體小鼠模型。
　　 10.受損肝臟組織RNA對(duì)ConA刺激的脾淋巴細(xì)胞反應(yīng):從WT和TLR3-/-小鼠分別獲取脾淋巴細(xì)胞,加入96孔培養(yǎng)板中,然后加入1μg/ml ConA刺激,并加入通過反復(fù)凍融導(dǎo)致的壞死肝臟

16、組織提取的RNA、ConA、陰性對(duì)照進(jìn)行刺激。
　　 11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有的數(shù)據(jù)表示為means±SD或means±SE。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用GraphPad Prism軟件4.0進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果
　　 Con A注射后,肝臟單個(gè)核細(xì)胞和竇狀內(nèi)皮細(xì)胞的TLR3表達(dá)上升； TLR3-/-小鼠在Con A誘導(dǎo)的肝炎中肝臟損害比野生型小鼠明顯減輕。而且,TLR3-/-小鼠的脾淋巴細(xì)胞對(duì)壞死肝臟組織RNA和Con A刺激

17、的增殖反應(yīng)比正常小鼠的脾淋巴細(xì)胞要弱。為了確定在Con A誘導(dǎo)的肝炎中表達(dá)在造血系細(xì)胞還是非造血系細(xì)胞的TLR3在肝臟損害中的作用,我們生成了骨髓嵌合體小鼠。移植正常小鼠造血系后的TLR3-/-小鼠和移植TLR3-/-小鼠造血系后的正常小鼠在Con A誘導(dǎo)的肝臟損害中都得到相似的保護(hù)作用。這表明在非造血系細(xì)胞和造血系細(xì)胞的TLR3信號(hào)通路在介導(dǎo)肝臟損害中都起到重要作用。
　　 結(jié)論
　　 1.TLR3信號(hào)通路在ConA誘