鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)在白念株菌氧化壓力應(yīng)答中的功能研究.pdf

1、作為人類主要的條件性致病真菌，白念珠菌在侵染人體時會引起機體的一系列功能障礙，而免疫抑制藥物的廣泛使用更使該致病菌引起的感染逐年上升，關(guān)于該致病菌的致病機制亟需研究。
　　類似于其他真核生物，白念珠菌利用自身保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來應(yīng)對外界壓力，而鈣信號途徑更是在這方面發(fā)揮重要作用。外界刺激會引起菌體內(nèi)Ca2+濃度的變化，進而起始菌體參與應(yīng)對外界環(huán)境壓力。鈣調(diào)素是真核細胞鈣信號途徑中的一個主要調(diào)控蛋白。胞漿內(nèi)鈣離子濃度的升高會促使鈣調(diào)

2、素同鈣離子結(jié)合，進而控制菌體內(nèi)參與代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶的活性。釀酒酵母中，鈣離子/鈣調(diào)素作用靶點主要是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶及Ⅱ型鈣離子/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(typeⅡ Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases，CaMKs)。CaMKs調(diào)節(jié)的磷酸化過程是生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)過程中的關(guān)鍵步驟，涉及廣泛的生理過程。到目前為止，盡管白念珠菌鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中的許多成員已為人們所熟知，但仍有許多代謝調(diào)控機制亟需探討。本研究

3、主要包括以下內(nèi)容:
　　(1)通過BLASTP分析，本研究在白念珠菌中鑒定出了釀酒酵母同源ECM7基因。通過構(gòu)建ecm7△/△缺失株，本研究發(fā)現(xiàn)Ecm7作為高親和性鈣離子內(nèi)流系統(tǒng)（high affinity Ca2+ influx system，HACS）的一個潛在調(diào)控因子，在菌體維持鈣離子穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，同時發(fā)現(xiàn)Mid1是Ecm7穩(wěn)定性維持所必需的。ECM7基因的缺失能夠?qū)е戮w對低鈣環(huán)境的敏感性，同樣導(dǎo)致菌體在堿性刺激下

4、胞外鈣離子內(nèi)流減少。免疫印跡實驗結(jié)果進一步指出，Cch1及Mid1的缺失并不影響Ecm7的表達，但Mid1的缺失能顯著降低Ecm7的穩(wěn)定性。此外，ecm7△/△菌株對氧化壓力表現(xiàn)出高度的敏感性。ECM7基因的缺失不僅使菌體內(nèi)參與氧化壓力應(yīng)答基因的表達下調(diào)，而且顯著降低Cap1的穩(wěn)定性。本研究還發(fā)現(xiàn)，ECM7基因的缺失能導(dǎo)致菌體菌絲發(fā)育缺陷，同時伴隨著菌體內(nèi)HWP1表達的下調(diào)。鑒于白念珠菌的致病性同其菌絲發(fā)育密切相關(guān)，本研究進一步進行小鼠

5、毒力實驗。結(jié)果表明，ECM7基因的缺失并不影響菌體對小鼠的毒力，但卻導(dǎo)致菌體對小鼠腎臟的侵襲力及擴散能力顯著降低。
　　(2)為了進一步研究鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)在白念珠菌應(yīng)對外界環(huán)境壓力中的作用，本研究構(gòu)建了CaMK缺失株。結(jié)果表明，CaMKs在維持菌體細胞壁完整性(cell wall integrity，CWI）及調(diào)控胞內(nèi)還原狀態(tài)方面發(fā)揮重要作用。在熒光增白劑(CFW)作用下，CMK1，CMK2單基因或雙基因的缺失能激活CWI，使CWI相