RUNX3基因甲基化修飾及其下游AKT信號通路在人肺腺癌化療耐藥表型中的作用研究.pdf

1、肺癌目前是世界上最常見的惡性腫瘤，嚴重危害人類健康。近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率呈急劇上升的態(tài)勢。在北美，肺癌的5年生存率僅為15％，我國則更低。肺癌通常分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，在NSCLC中，肺腺癌發(fā)病率上升明顯，在許多國家已超過鱗狀細胞癌成為最常見的肺癌組織類型。肺癌起病非常隱匿，約3/4的患者在初診的時候就已經(jīng)發(fā)生了晚期轉(zhuǎn)移，手術(shù)的機會受到了很大的限制，因此化療仍然是肺癌臨床治療的重要手段之一。雖然

2、在過去的二十余年對肺癌的生物遺傳學行為的研究有了很大的進展，但至今仍然沒有很有效的方法可以治愈肺癌?；熌退幍拇嬖谌匀恢萍s著肺癌治療取得進一步效果。大多數(shù)患者的死因與耐藥之間存在著直接或者間接的關系，如何逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性將是提高腫瘤化療效果的關鍵。隨著第三代化療藥物的應用，NSCLC的化學治療有了很大進步。多西紫杉醇(docetaxel，多西他賽)是第三代化療藥物中的代表藥物之一，它的前體是從歐洲紫杉針葉中提取，經(jīng)半合成而獲得，其作

3、用機理主要是促進細胞內(nèi)微管雙聚體聚合，從而形成穩(wěn)定的微管聚合物，抑制其解聚，使游離的微管數(shù)量顯著減少，從而抑制腫瘤細胞的有絲分裂和增殖，導致腫瘤細胞死亡，具有較高的抗腫瘤活性。但與其他化療藥物一樣，耐藥現(xiàn)象的存在限制了其有效應用。然而，有關多西他賽的耐藥機制，國內(nèi)外研究尚不充分。本課題組前期首先通過逐漸增加藥物濃度在體外誘導篩選出對多西他賽耐藥的肺腺癌細胞株(SPC-A1/DTX，H1299/DTX)，并觀察了耐藥細胞與親本細胞(SPC

4、-A1，H1299)之間的生物學特性差異。隨后，通過cDNA表達芯片與甲基化芯片的分析，我們最終篩選出RUNX3與多西他賽化療藥物敏感性相關，并進行深入的研究。體外功能實驗表明，SPC-A1/DTX和H1299/DTX細胞中RUNX3過表達可抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、誘導細胞G1期阻滯并增加多西他賽化療敏感性;而SPC-A1和H1299細胞中抑制RUNX3表達則起到相反效果。通過建立移植瘤動物模型，腹腔注射多西他賽，來觀測腫瘤的生長，

5、結(jié)果進一步表明瘤內(nèi)穩(wěn)定高表達RUNX3可以明顯增強多西他賽的化療敏感性。通過定制的Realtime-PCR芯片，我們發(fā)現(xiàn)以上結(jié)果可能的機制為RUNX3能夠抑制AKT信號通路的激活，并經(jīng)共轉(zhuǎn)染Akt1持續(xù)活化質(zhì)粒實驗驗證。臨床標本中的結(jié)果也表明，肺腺癌組織RUNX3表達與Akt1呈負相關，且RUNX3高表達提示患者采用含多西他賽輔助化療方案的無病生存期(DFS)較短?？傊呒谆T導的RUNX3下調(diào)可能通過對AKT信號通路的活化參與肺腺

6、癌多西他賽耐藥機制，RUNX3基因可望成為肺腺癌多西他賽化療敏感性的預測指標及逆轉(zhuǎn)耐藥的潛在靶點。
　　 第一部分人肺腺癌耐多西他賽細胞株與親本細胞株的cDNA表達與甲基化芯片差異
　　 目的:探討肺腺癌耐藥細胞系(SPC-A1/DTX)與親本細胞系(SPC-A1)中基因表達差異與啟動子甲基化差異譜。
　　 方法:借助上海伯豪生物技術(shù)有限公司Affymetrix cDNA芯片服務平臺對SPC-A1/docetax

7、el和親本SPC-A1細胞進行cDNA差異表達譜進行篩選（重復三次），經(jīng)過濾條件篩選到的數(shù)據(jù)進行SAM分析，篩選出cDNA差異表達譜，并通過Realtime-PCR進行驗證。同時依托臺灣華聯(lián)生物科技有限公司(PhalanxBiotech Group)高通量DNA甲基化芯片篩選平臺技術(shù)對SPC-A1/docetaxel和親本SPC-A1細胞進行DNA甲基化差異譜進行篩選（重復三次），經(jīng)過濾條件篩選到的數(shù)據(jù)進行SAM分析，篩選出DNA甲基化

8、差異表達譜，并通過MSP進行驗證。
　　 結(jié)果:耐藥細胞系(SPC-A1/DTX)中，從cDNA表達芯片數(shù)據(jù)中篩選出基因表達下降最明顯的有:SERPINB5（60.9倍），LUM（57.3倍），ING4（39.4倍），CYP1A1(33.8倍),RASIP1(24.5倍),SFRP1(24.15),RNASEK(22.1倍),TMPRSS11F(20.4倍)，GALR2（18.7倍），KRT15（18.5倍），RUNX3（17.

9、8倍），ABCG2（17.1倍），ABCC3（16.5倍）。甲基化芯片數(shù)據(jù)顯示甲基化發(fā)生率(△_beta＞0.8)的有FOXO1A(0.952),ADAM33(0.915), CEBPA(0.897), SFRP1(0.882),FLNC(0.873), DAPK1(0.862), SNX9(0.842), MATN2(0.831), NAP1L5(0.819), STAP2(0.816), ADAM12(0.807), HOXD11(

10、0.806), F2R(0.804),TAPBPL(0.803)，MMP14(0.802)，RUNX3(0.801)。最終發(fā)現(xiàn)兩個芯片有一個共同基因:RUNX3。MSP和Realtime-PCR芯片證實RUNX3基因在 SPC-A1/DTX中發(fā)生高甲基化且表達明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論:啟動子甲基化誘導的RUNX3基因表達下調(diào)很有可能參與了肺腺癌細胞SPC-A1/DTX的多西他賽耐藥，有望為肺腺癌多西他賽化療提供有價值的分子標記物，

11、并為逆轉(zhuǎn)其耐藥表型提供潛在的分子治療靶點。
　　
　　 第二部分 RUNX3在肺腺癌中的體內(nèi)與體外的功能分析
　　 目的:利用體內(nèi)、外模型，從細胞增殖、凋亡和細胞周期等方面驗證RUNX3參與調(diào)節(jié)人肺腺癌細胞多西他賽化療敏感性。
　　 方法:通過MTT法和Realtime-PCR檢測不同濃度5-Aza-dc處理48小時后SPC/DTX、H1299/DTX細胞對多西他賽的IC50及RUNX3的基因表達改變;

12、通過合成RUNX3基因表達載體(N-eGFP-RUNX3)和RNA干涉載體(pGPU-shRUNX3)并分別轉(zhuǎn)染人肺腺癌SPC-A1/DTX、H1299/DTX，SPC-A1、H1299細胞，人為改變細胞內(nèi)RUNX3表達水平，MTT法測定細胞對多西他賽敏感性差異;克隆形成實驗測定細胞體外增殖能力差異;流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡率差異。將SPC-A1/DTX分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照(NC-eGFP)和(RUNX3-eGFP)后建立裸鼠皮下移植

13、瘤模型，成瘤后定時給予多西他賽腹腔注射并繪制腫瘤生長曲線，適時處死動物后取瘤體組織，免疫組化染色檢測RUNX3、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）陽性率差異。
　　 結(jié)果:10μM5-Aza-dc處理SPC/DTX、H1299/DTX細胞后，其對于多西他賽的IC50值顯著下降，RUNX3未甲基化比例明顯升高，RUNX3表達明顯升高。在SPC-A1/DTX和H1299/

14、DTX細胞中人為上調(diào)RUNX3表達水平后，細胞對多西他賽敏感性顯著提高(P＜0.01)，細胞體外增殖能力下降(P＜0.01)，細胞早期凋亡率增加(P＜0.01)，細胞周期G1期顯著阻滯（P＜0.01）及G2/M期減少(P＜0.01);相反，在SPC-A1和H1299細胞中人為下調(diào)RUNX3表達水平后，細胞對多西他賽敏感性顯著降低(P＜0.05)，SPC-A1細胞體外增殖能力下降(P＜0.05)，細胞周期G1期減少(P＜0.05)并出現(xiàn)G

15、2/M期增加(P＜0.05)。在裸鼠移植瘤模型中，人為上調(diào)RUNX3表達水平并給予多西他賽化療可協(xié)同抑制SPC-A1/DTX細胞的成瘤能力，顯著增加腫瘤細胞對多西他賽治療的反應性，并誘導瘤體組織內(nèi)PCNA表達降低，提示細胞增殖能力受阻。
　　 結(jié)論:小劑量5-Aza-dc可能通過去除RUNX3啟動子甲基化狀態(tài)，上調(diào)RUNX3基因表達而部分逆轉(zhuǎn)SPC-A1/DTX和H1299/DTX細胞對多西他賽的化療耐藥。RUNX3可在體內(nèi)、外

16、對肺腺癌細胞產(chǎn)生顯著的多西他賽化療增敏作用，同時伴有細胞增殖受阻、凋亡增加，以及細胞周期分布的明顯變化。
　　
　　 第三部分RUNX3對下游AKT信號通路的作用
　　 目的:進一步探討RUNX3參與調(diào)節(jié)人肺腺癌細胞多西他賽化療敏感性的可能機制。
　　 方法:將RUNX3基因表達載體(NC-eGFP)和（RUNX3-eGFP）分別轉(zhuǎn)染人肺腺癌耐藥細胞系(SPC-A1/DTX)，使用常州楚天生物有限公司定

17、制腫瘤表達譜PCR芯片應用實時熒光PCR同時對腫瘤信號通路相關的88個基因進行表達分析。芯片包含了與細胞周期，細胞凋亡，DNA修復，血管的形成以及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的相關一系列基因。發(fā)現(xiàn)Akt/GS3Kβ/β-catenin信號通路為RUNX3下游多西他賽耐藥主要相關信號通路。通過RUNX3基因過表達載體（RUNX3-eGFP）與持續(xù)活化AKT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SPC-A1/DTX細胞，人為逆轉(zhuǎn)RUNX3過表達對耐藥細胞株的影響，Western bl

18、ot檢測Akt/GS3Kβ/β-catenin下游末端靶分子的蛋白表達。對人類肺腺癌親本細胞株(SPC-A1)使用AKT抑制劑（MK-2206），MTT法測定細胞對多西他賽敏感性差異;克隆形成實驗測定細胞體外增殖能力差異;流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡率差異。選取39例使用過包含多西他賽化療方案的肺腺癌術(shù)后腫瘤組織樣本，通過免疫組化檢測組織中RUNX3和AKT表達情況，采用Kaplan-Meier生存曲線分析患者生存。
　　 結(jié)果

19、:在人肺腺癌耐藥細胞系(SPC-A1/DTX)中過表達RUNX3后，Akt1，p-AKT,p-GSK3β，β-catenin，CyclinD1，bcl-2，bcl-xl蛋白表達顯著下降，而p21，Bax則顯著上升，而共轉(zhuǎn)染持續(xù)活化Akt質(zhì)粒則可逆轉(zhuǎn)RUNX3過表達引起的上述改變。在人類肺腺癌親本細胞系(SPC-A1)中通過抑制AKT信號通路，顯著增加細胞對多西他賽的敏感性(p＜0.01)，抑制細胞增殖能力(p＜0.05)，有效阻滯G1期

20、(p＜0.01)并減少G2/M期(p＜0.01)，但細胞早期凋亡率無明顯變化(p＞0.05)。在肺腺癌臨床組織樣本中，RUNX3的表達水平與Akt1的表達（Spearman，rho=-0.607，p＜0.01）存在負相關，且RUNX3高表達提示患者無病生存期(Disease Free Survival, DFS)不佳(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:RUNX3可以顯著抑制Akt1的表達和Akt/GS3Kβ/β-catenin信號通