miR-134靶向沉默ANGPTL4對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化（atherosclerosis,As）是一種脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)等多種機(jī)制相互作用而產(chǎn)生的慢性炎癥性疾病，其中巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng)是其發(fā)病的兩個關(guān)鍵因素。脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）是脂肪酶基因家族中可以水解甘油三脂的核心限速酶，而巨噬細(xì)胞中LPL則可以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子表達(dá)，從而促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成及As的發(fā)生發(fā)展。血管生成素樣蛋白4（angiopoietin-like

2、4，ANGPTL4）是血管生成素樣蛋白家族的成員之一，越來越多的研究表明ANGPTL4可以抑制LPL活性，過表達(dá)巨噬細(xì)胞中ANGPTL4可以降低巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞形成。近年來研究發(fā)現(xiàn)越來越多的microRNA可以通過多種脂質(zhì)代謝信號途徑參與As的發(fā)生發(fā)展。最新研究顯示miR-134與心肌梗死等心血管疾病密切相關(guān)，He等人在動脈硬化患者的血管內(nèi)膜、血漿和巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-134是高表達(dá)的，提示miR-134促進(jìn)As的發(fā)生發(fā)展，

3、但機(jī)制尚不明確。通過生物信息學(xué)軟件分析我們發(fā)現(xiàn)miR-134具有靶向結(jié)合ANGPTL4的生物學(xué)基礎(chǔ)，本研究目的旨在探討miR-134在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制，為防治As提供新的研究策略和治療靶點。
　　方法:利用多種生物信息學(xué)MicroRNA相關(guān)網(wǎng)站預(yù)測各物種miR-134序列、保守性、miR-134靶標(biāo)基因、與ANGPTL4結(jié)合位點、靶標(biāo)結(jié)合評分、莖環(huán)結(jié)構(gòu)和自由能評分等。采用雙熒光素酶報告基因法驗證miR-134與A

4、NGPTL43’UTR具有靶向結(jié)合作用。THP-1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同濃度(0,10,20,40,80nM)和不同時間（0、6,12,24,48h）后，Western blot檢測ANGPTL4蛋白水平，實時定量PCR法檢測ANGPTL4 mRNA水平。利用LPL活性試劑盒檢測miR-134 mimic對巨噬細(xì)胞中LPL活性的影響,采用TG試劑盒和HPLC檢測miR-134 mimic對細(xì)胞內(nèi)TG及TC、FC和CE的含量的影響，還檢測miR

5、-134對巨噬細(xì)胞中介導(dǎo)脂質(zhì)攝取的受體SR-A和CD36表達(dá)影響以及LPL和LRP-1結(jié)合情況。觀察miR-134 mimic等對巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10分泌的影響。
　　結(jié)果:生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示miR-134在不同物種進(jìn)化中高度保守，多個靶標(biāo)預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測預(yù)測綜合評分較高，這些結(jié)果顯示miR-134具有靶向結(jié)合ANGPTL4的生物學(xué)作用。細(xì)胞轉(zhuǎn)染ANGPTL4野生型和突變型3’UTR后，mi

6、R-134組與對照組相比雙熒光素酶活性明顯降低，而突變型3’UTR組雙熒光素酶活性明顯增加，證實miR-134靶向結(jié)合ANGPTL4的生物學(xué)。miR-134還呈劑量和時間依賴性下調(diào)巨噬細(xì)胞中ANGPTL4表達(dá)，上調(diào)LPL表達(dá)和活性，上調(diào)巨噬細(xì)胞SR-A和CD36受體的表達(dá)和LPL和LRP-1結(jié)合，增加巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。miR-134 mimic還可以上調(diào)促炎因子TNF-α、MCP-1、IL-6分泌，下調(diào)抑炎因子IL-10分泌，而miR-